я скоплением недифференцированных клеток, либо меняется и из пего дифференцируются другие структуры имаго. Так, из антеннального диска может образоваться не антенна, а крыло. При продолжительном культивировании с пересадками способность дисков к дифференцировке меняется вполне закономерно (рис. 13-5).

Над чем же работают теперь? С недавнего времени усилия ученых сконцентрированы на двух направлениях исследований. Одно направление — это изучение способности дисков дифференцироваться in vitro (в определенной среде под действием очйщеп-пых гормонов насекомых). Другое — выращивание клеток дисков in vitro предпочтительно из-одиночных родительских клеток. Можно надеяться, что такой экспериментальный подход позволит выяснить генетические и молекулярные основы сохранения и закономерного изменения способности к дифференцировке.

И наконец, клоны дифференцирующихся in vitro клеток цыпленка, мыши и человека. Перечитайте последпий абзац, поскольку в нем идет речь о цели исследований, описываемых в этом разделе.

Когда исследователи только еще начинали заниматься культурой клеток животных, они были довольны, если какая-нибудь клетка дезагрегированной ткани, помещенная в жидкую питательную среду, размножалась в чашке Петри. Независимо от того, какую брали ткань, всегда интенсивно делились веретеновидные клетки, называемые фибробластами. Клопы фибробластов можно было пассировать много раз, и их потомки всегда оставались фибробластами. В то же время получать клоны мышечных клеток, хондроцитов и т. д. не удавалось, хотя при кратковременном культивировании фрагментов интактпых тканей зародыша, которые сравнительно мало растут в этих условиях образуются поперечнополосатая мускулатура, хрящ, почечные канальцы и т. д.

Теперь мы знаем, с чем были связаны неудачи клонирования дифференцированных клеток. Во-первых, в ткани животных обычно, кроме дифференцированных клеток, есть стволовые клетки и фибробласты.' Последние быстро адаптируются в новых условиях среды и размножаются гораздо быстрее остальных. В результате

Рис. 13-5. Изменение способности к дифференцировке и морфогепезу в процессе серийпых пересадок имагинальных дисков.

Изменения обычно обратимы, за исключением диска, из которого при пересадке образуется грудной отдел.

фибробласты забивают все другие клетки. Во-вторых, выяснилось, что большая группа дифференцирующихся клеток может так изменять среду культивирования, что она будет способствовать их нормальной дифференцировке. Только стволовые клетки не обладают этим свойством. Поэтому, хотя клетки способны к дифференцировке, окружающая среда не позволяет им проявить эту способность. Отсюда следует, что среда, в которой культивируют клоны

клеток, должна быть специальным образом подготовлена (см. далее).

»1Ш

?НИ

* ^ ШИП

XBSH

ШшШШш

Рис. 13 0. Мышечные клетки из колонии, выращенной in vitro.

поперечнонечерченные миофибриллы.

Видны

Впервые удалось получить клоны мышечпых клеток цыпленка. Ножную мышцу 12-дневного зародыша курицы дезагрегировали, обрабатывая протеолитическим ферментом, и культивировали клетки в стериалыюй питательной среде. Плотность их была достаточно низкой, чтобы могли образовы-вываться изолированные клоны. Среда была подготовлена, т. е. в ней предварительно инкубировали очень большое число мышечпых клеток зародыша, причем инкубировали достаточно долго, чтобы создать условия, способствующие развитию мышц, но не пастолько долго, чтобы отравить среду или истощить запас питательных веществ в ней. Через 1—2 нед, когда колонии были уже достаточно велики (рис. 13-6), выяснилось, что образовались два типа колоний. Большинство колоний представляло собой компактную массу клеток; края таких колоний были гладкими (это колонии фиброблас-тов). В состав мепыпей части колоний входили вытянутые многоядерные клетки, содержащие поперечнополосатые сократимые волокна, т. е. типичные мышечные клетки (рис. 13-7). Колонии мышечных клеток снимали с поверхности чашки Петри, дезагрегировали и вновь культивировали. Большинство возникающих при этом колоний было типичпыми колониями мышечных клеток, однако было немало колоний фибробластов. Последние, если их пересаживать, образуют только фибробласты. Если пассировать колонии мышечных клеток, то опять образуется 2 типа колоний, но преобладают колонии мышечпых клеток. Таким образом, способность к дифференцировке наследовалась, но Не так уж строго.

Процессы роста и дифференцировки мышечных клеток в культуре очень сходпы с соответствующими процессами, происходящими в зародыше. Можно видеть, что в течение первых 4—5 дней культивирования одиночная родительская клетка образует клон, состоящий приблизительно из 50 одноядерных клеток (5—6 поколений). Затем клетки начинают сливаться, соединяясь своими

Рис. 13-7. Развитие колонии мышечных клеток in vitro.

A. Родительская клетка. Б. Одиночные одноядерные дочерние клетки.

B. Дочерние клетки начали сливаться и дифференцироваться в мышцу. Г. Более поздняя стадия; обратите внимание на то, как расположенная рядом (внизу, слева) колония фибропластов начинает внедряться в колонию мышечных клеток.

концами и образуя многоядерные мышечные трубочки. Они больше не растут. Неслившиеся же сестринские клетки продолжают расти и делиться; некоторые из их потомков сливаются друг с другом или с уже* сформировавшимися мышечными трубочками. Таким образом, одноядерные клетки являются истинными стволовыми клетками. В новообразованных мышечных трубочках начинается синтез специфических белков и образуются типичные поперечнополосатые сократимые волокна.

Кондиционированная среда. Сейчас отпала необходимость в предварительной подготовке среды, обеспечивающей развитие мышечных клеток. Оказалось достаточным просто добавлять коллаген к обычной свежеприготовленной среде. Коллаген — высокопо-лимерпый белок. Оп состоит из коротких фибрилл, соединенных между собой и образующих длинные извитые волокна. Волокна переплетаются друг с другом, образуя так называемые базальные мембраны, играющие существенную роль в жизнедеятельности некоторых тканей. Мышцы — одна из них. Окончательно еще не выяснено, как коллаген способствует дифференцировке мышц. Особенно интересно, что коллаген синтезируют и секретируют фибробласты, которые в организме тесно связаны с мышцами. Там их рост сбалансирован с ростом мышечных стволовых клеток, в чашках же Петри рост их становится неконтролируемым и создает трудности при проведении исследований.

Для дифференцировки других клеток требуются свои, особые условия. Например, эпидермис зародыша цыпленка в отсутствие витамина А превращается в кубический эпителий, покрытый ресничками. Эктодерма, взятая из разных участков зародыша, в этих условиях дифференцируется по-разному. Клетки могут секретиро-вать слизь, и тогда образующаяся ткань становится похожей на слизистую оболочку носа — его внутреннюю выстилку, или в клетках могут образоваться впячивания и канальцы, и они превратятся в различные секреторные клетки. Те же самые клетки в присутствии витамина А начинают синтезировать большое количество кератина — белкового компонента кожи, и из них образуется кожа, имеющая характерное строение. На пей появляются зачатки перьев, из которых затем развиваются небольшие, нормально пигментированные перышки. Пока еще не получили клонов этих клеток, но я готов держать пари, что когда это произойдет, то окажется, что самый важный фактор среды, в которой идет дифференцировка кожи,— витамин А, а его. отсутствие — необходимое условие для дифференцировки слизистого эпителия.

В других случаях факторы кондицирпироваппой среды еще не идентифицированы. Так, клоны хрящевых клеток можпо получить только в присутствии пеидентифицированных веществ, выделенных из эмбриональпого зкстракта. В их отсутствие клетки нормально растут и образуют клопы, но не синтезируют межклеточные полисахариды типа хопдроитипа, образующие характерный хрящевой матрикс (рис. 13-8).

Систематическая селекция клеточных линий, дифференцирующихся in vitro. Методы селективного обогащения — мощное средство микробиологов. Например, вы хотите получить мутацию у бактерий, при которой синтезируется, или, наоборот, не синтезируется какой-либо метаболит, или он производится в избыточном количестве. Вам может оказаться необходимым мутант, чувствительный или резистентный к этому метаболиту, или, наконец, мутант, превращающий его в интересующий вас продукт. Для этого необходимо только так составить среду, чтобы она способствовала росту мутантов и тормозила в то же время рост родительского клона, в котором они возникают; другими словами, чтобы отбор нужных мутантов происходил автоматически. Остановка лишь за вашей изобретательностью.

Такой же прием использовали для отбора клонов клеток животных, которые не только сохраняют способность к дифференцировке, но и интенсивно растут in vitro. Начинают с опухолевых клеток, поскольку они обычно лучше растут, чем соответствующие нормальные клетки. При этом выбирают опухоль, способную выполнять специфические функции органа, в котором она образовалась. В качестве примера можно назвать опухоль надпочечников мыши, которая, как и нормальная железа, способна синтезировать специфические' кортикостероиды под действием гормопов гипофиза. Опухолевые клетки культивируют в специальной питательной среде. Сначала, пока клетки не адаптировались к условиям среды, они растут очень медленно, значительно медленнее, чем фибро-бласты, засоряющие культуры опухолевых клеток. Приблизительно через педелю опухолевые клетки реимплантируют в мышь, у которой перед этим удаляют падпочечпики. Там уже они, а не фибробласты, интенсивно размножаются и образуют огромную опухоль. Поскольку она выполняет функцию надпочечников, адре-налэктомированные мыши еще некоторое время живут, но в конце концов должны погибнуть от неограниченного роста опухоли. Прежде чем это произойдет, опухоль опять извлекают, дезагрегируют на клетки и культивируют их в чашке Петри. Так, переводя опухоль из адреналэктомироваппых мышей в культуру in