ние h между нуклеотидами по вертикали, а номер слоевой линии /, на которой находится рефлекс, дает число нуклеотидов и на виток [95].

Дифракционные картины спиральных молекул часто имеют крестообразный вид. Такой же вывод следует и из формулы для структурного фактора в случае рассеяния на волокнах [уравнение (3.6)]; эта формула аналогична формуле (3.3) с той лишь разницей, что (3.6) содержит вместо экспоненты функции Бесселя J„, так как атомные координаты представлены в цилиндрической системе координат (см. рис. 2.15) [95-101]. С увеличением и положение первого основного максимума функции Бесселя сдвигается в область больших R; в результате картина дифракции напоминает косой крест (рис. 3.9, Л).

Чтобы построить модель, по которой определяются координаты атомов, достаточно знать параметры спирали, параметры элементарной I ячейки, которые получают из рентгенограммы, и стереохимию моно-

58

Глава 3

мерных единиц и их ассоциатов, образующихся с помощью водородных связей и стэкинга. Координаты атомов используются для расчета интенсивности дифракции (фурье-преобразование спирали) для каждой слоевой линии по формулам (3.6) и (3.7). Для проверки правильности построенной модели ее сопоставляют с рентгеновской дифракционной картиной. Если необходимого соответствия нет, модель модифицируют путем изменения торсионных углов остова, конформации сахарного кольца, а также путем минимизации потенциальной энергии. Последний этап минимизации разности между значениями наблюдаемых и расчетных структурных амплитуд проводят методом наименьших квадратов с наложенными связями [100, 102]. Значения R-фактора обычно лежат в интервале 0,25-0,4.

Существенно, что из-за отсутствия экспериментальных данных о фазах при расчетах можно не обнаружить, что модель неправильна. Можно привести три примера подобного рода: poly (С), poly(I) и poly(G). Вначале предполагали, что poly (С) представляет собой двойную спираль [103], однако позже, после получения дополнительных данных и более качественных рентгенограмм, было установлено, что этот полимер находится в форме одиночной спирали [104] (разд. 13.1). Далее, вначале считали, что poly(I) и poly(G) существует в виде тройной спирали [105], однако спектроскопические и последние кристаллографические данные показали, что эти полимеры представляют собой четырехцепочечную спираль [106] (разд. 13.6). Литература, в которой рассматриваются доводы за [116-122] или против [33, 107-115] модели Уотсона-Крика, весьма поучительна. Хотя во всех альтернативных моделях тоже предполагалось предпочтительное спаривание гуанина с цитозином и аде-нина с тимином (урацилом), тем не менее рассматривались два типа

Рис. 3.9. А. Схема эксперимента по рассеянию рентгеновских лучей на волокнах (съемка на плоскую пленку [165]). Монохроматический пучок проходит через коллиматор диаметром 0,1-0,2 мм; ось волокна и плоскость пленки перпендикулярны направлению падающего рентгеновского луча. Угол рассеяния 0 и расстояния между плоскостями определяются по уравнению (3.1). Б. Рентгенограмма ДНК из тимуса теленка в В-форме (с любезного разрешения д-ра С. Арнотта и д-ра Р. Чандрасекарана). Крестообразное расположение рефлексов («косой крест») типично для спиральных молекул. Расстояние между слоевыми линиями дает шаг спирали. Сильный меридиональный рефлекс на десятой слоевой линии, соответствующей расстоянию 3,4 А, указывает на то, что на один виток спирали приходится 10 нуклеотидов, расположенных на расстоянии 3,4 А друг от друга; плоскости оснований примерно перпендикулярны оси спирали. Если бы при экспозиции волокна располагались строго перпендикулярно относительно падающего пучка, то рентгенограмма была бы зеркально симметрична относительно экватора. Однако для того, чтобы получить сильный меридиональный рефлекс на десятой слоевой линии, все пары оснований надо вывести в отражающее положение, а для этого приходится слегка наклонять волокна, вследствие чего строгая симметрия пропадает.

Методы

59

Меридиан

Меридиан

Б —

А-ДНК

В-ДНК

si.

¦ •w* ..... л

^f>*j^4» ^ .....

I

D-ДНК

... «Г * л * « . 1

Рис 3.9. В. Сравнение рентгенограмм А-, В-, С-, D- и Z-ДНК, любезно предоставленных д-ром С. Арноттом и д-ром Р. Чандрасекараном. Кольцо точечных рефлексов на рентгенограмме А-ДНК обусловлено присутствием кальпи-та, который напыляют для калибровки рентгенограммы. Это кольцо соответствует межплоскостному расстоянию 3,03 А. Все рентгенограммы приведены в одном масштабе. Чтобы получить сильный меридиональный рефлекс, по которому определено число пар оснований на виток (11, 10, 9, 8 и 12 соответственно от А- до Z-ДНК), волокна отклоняли от перпендикулярного рентгеновскому пучку направления. В случае Z-ДНК меридиональный рефлекс появляется в середине «косого креста» на шестой слоевой линии, поскольку повторяющейся единицей здесь является динуклеотид (pCpG), а не мононуклеотид, как у всех других форм ДНК (гл. 12).

Методы

61

геометрии спаривания: по Уотсону - Крику и по Хугстену; кроме того, обсуждалась модель ДНК, в которой цепи не переплетаются, а располагаются бок о бок (гл. 14).

3.5. СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Структуру нуклеиновых кислот в растворе исследуют спектрофотометри чески в УФ- и ИК-области, методами кругового дихроизма (КД) и лазерной рамаиовской спектроскопии, с помощью измерения флуоресценции, рассеяния света и методом ЯМР. Все эти методы описаны в обзорах •[123 129]. Наиболее информативным среди спектроскопических методов является ЯМР. ЯМР на ядрах 1Н, 13С, 15N и 31Р применялся для исследования моно-, олиго- и полинуклеотидов [129^132]. Три параметра спектров ЯМР-химический сдвиг 6, константа спин-спинового взаимодействия (J) и время спин-решеточной релаксации Tt зависят от конформационных характеристик и межмолекулярных взаимодействий. В частности, химический сдвиг 8 зависит от спаривания оснований И стэкинга и очень чувствителен к химическому окружению оснований в стопке. Кривые изоэкранирования, которые при этом используются, рассчитывают методами квантовой химии, из них получают представление о кольцевых токах в ароматических кольцах [133, 135].

Константа спин-спинового взаимодействия J зависит от торсионного угла G, который определяется четырьмя атомами X—С—С—Y или, •если речь идет об атоме фосфора, X—С—О—P. X и Y-это вици-нальные (т.е. связанные с двумя соседними атомами углерода) атомы XH, 13С, 31Р. Угол G определяется по формуле Карплюса [136]:

3JBw = A cos2G — В cos G + С(Гц). (3.12)

Индекс 3 перед /виц означает, что груP?па X—С—С—Y содержит три связи; А, В, С-константы, зависящие от природы заместителей при центральных углеродных атомах. Для вицинальных протонов в сахарах в составе нуклеозидов А = 10,2; В — 0,8; С = 0,0 Гц. Эти константы получены по всей совокупности имеющихся данных о ЯМР этих молекул 1130].

Константы спин-спинового взаимодействия можно связать с заселенностью С{-эндо (S)- и С^-эндо (М)-семейств, применив принцип псевдовращения (разд. 2.5) [130132, 137]. Как правило, процентное содержание конформеров S и N в растворе определяется как 10-и Г10-37з<4<, а константа равновесия для перехода N«±S в хорошем приближении равна

K^3J^2./3J3W. (3.13)

Для более детального анализа используются все три константы -3J12s 3^2'з' и 3-^з'4'> а также диаграммы, связывающие кон-

62

Глава 3

станты взаимодействия с конформационными параметрами [130, 138, 139]1.

Конформеры с разным торсионным углом относительно связи С4—С5' можно разграничить с помощью константы 3J45' [130-132]. Взаимное пространственное расположение протонов при атомах С4- и С5> в — ск-и аи-конформациях одинаково (см. рис. 2.11), поэтому различить эти конформеры с помощью ЯМР не удается, и можно говорить лишь о смеси конформеров — ск и an. + Ск-конформация, однако, четко выявляется, что позволяет разграничить два основных семейства с разной ориентацией 05'-атома-«над» и «от» пятичленного сахарного кольца. Аналогичная ситуация возникает при рассмотрении вращения вокруг связи С5—05' в 5'-нуклеотидах, когда измеряется константа взаимодействия для атомов 'Ни 31 Р. Определить ориентацию относительно связи С3—03' в З'-фосфатах труднее, поскольку в этом случае может быть использован только один протон, связанный с атомом С3- [130-132].

Эту проблему можно решить путем учета вицинального взаимодействия 3J(31P, 13С) между атомами 31Р и 13С в группах Р—Оэ.—С3.—С2. или — С4- и Р—Os—С5—С4', дающего информацию об обеих эфирных связях С—О. Кроме того, можно использовать константу 2J(31P, 13С) для геминальных заместителей, т.е. заместителей, связанных с одним и тем же центральным атомом, как это имеет место в труппах Р—03—С3- и Р—05—С5- [130-132, 142-144]. Таким образом, методом ЯМР удается определить не только торсионные углы относительно связей С—С и С—О остова, но и конформацию сахара. Однако прямое определение ориентации относительно связи Р—О невозможно, поскольку в данном случае отсутствуют ядра, позволяющие определить подходящую константу взаимодействия [145, 146], и для получения хотя бы качественных результатов применяют другие методы, например метод, основанный на изменении химического сдвига при повышении температуры [147].

Ориентацию основания относительно сахарного кольца определяли несколькими методами. 1. Путем измерения времени спин-решеточной релаксации Tj [148]. 2. Методами, которые учитывают двойной резонанс между близко расположенными протонами и основаны на эффекте Оверхаузера [149, 150]. 3. С помощью изучения влияния рН. 4. Путем определения изменения химического сдвига протона сахара при связывании последнего с основанием. 5. По псевдоконтактному сдвигу [151-153, 138]. Результаты этих исследований не совсем совпадают. Так, первые два метода дают более высокую долю смн-конформеров, чем

1 Строго говоря, при значениях угла Н—С—С—Н, близких к таковым для син-перипланарной области (6 < 90°), уравнение Карплюса не является единственным, с помощью которого может быть описано взаимодействие ви-цинальных протонов 'Н1!!. Более того, некоторые исследователи считают его применение в этой области нерациональным [140, 141].

Методы

63

три других. Более достоверная информация получается при замещении атомов С2 и С6 в уридине на изотоп 13С и определении константы взаимодействия Vf^C^H) [154].

Если объединить все данные по ЯМР нуклеотидов, то можно получить общее представление о структуре этих молекул. За последние десять лет точность и чувствительность метода ЯМР существенно возросли, что позволяет успешно использовать его для исследования олиго- и полимерных систем [130-132, 145-147, 155, 156].

За структурными изменениями в нуклеотидах можно следить по изменению УФ- и ИК-спектров поглощения, а также спектров кругового дихроизма. Эти спектры очень чувствительны к изменению химического состава или пространственной структуры нуклеотидов и их полимеров. Например, УФ-спектр полинуклеотидов чувствителен к стэкингу между основаниями, и наблюдаемое увеличение поглощения (гиперхромизм) при переходе спираль-клубок с успехом используется для изучения этого процесса (гл. 6). Кроме того, УФ-спектр зависит от электронного состояния гетероциклических оснований и позволяет обнаружить химические модификации или эффекты протонирования/депротонирования оснований.

Спектры дисперсии оптического вращения (ДОВ) или кругового дихроизма (КД) оснований лежат в УФ-области. При связывании хромофора (основания) с какой-нибудь хиральной молекулой (например, фурано-зой) вблизи полосы поглощения наблюдается эффект Коттона (АДОВ). Следовательно, КД-спектры могут использоваться для выявления асимметричного окружения хромофора. Особенно ценны они для наблюдения за изменением локального окружения хромофора, например при переходе спираль-клубок.

ИК-спектры отражают колебательные состояния молекул. В области 1500 1700 см ~ 1, где основной вклад в поглощение вносят валентные колебания двойных связей, эти спектры оказываются чувствительными к заместителям оснований и поэтому могут использоваться для изучения кето-енольной таутометризации (разд. 5.4), а также процессов ассоциации оснований с помощью водородных связей. Недостатком метода "ляется то, что в этой области поглощает еще и вода, поэтому все измерения необходимо проводить в D20. Кроме того, коэффициент молярной экстинкции в ИК-области на порядок ниже, чем в УФ-области. Возможности этого метода существенно расширяет применение лазерной рамановской спектроскопии, которая позволяет получить совершенно новую информацию о колебаниях молекул. Для более глубокого ознакомления с этим вопросом можно обратиться к обзорам [127, 128].

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ

При изучении структуры нуклеиновых кислот применяются три разновидности метода рентгеновской кристаллографии. Небольшие моно-и олигонуклеотнды изучают обычными методами рентгеноструктурно-

64

Глава 3

го анализа монокристаллов. К глобулярным молекулам с четко выраженной пространственной структурой, таким как тРНК, применяют методы белковой кристаллографии. В обоих случаях структурные амплитуды и фазовые углы определяются из экспериментальных данных, и это приводит к однозначным результатам. В случае полимерных ДНК и РНК можно получить только квазикристаллические волокна, которые из-за ориентационной неупорядоченности дают относительно бедную дифракционную картину. Опираясь на данные по стереохимии мономерных и олигомерных частей молекулы, строят ее модель. Фурье-преобразование этой модели сравнивают с экспериментальной дифракционной картиной; при этом не исключено, что неправильная модель тоже хорошо согласуется с экспериментом. Расчет потенциальной энергии системы дает информацию о конформационной подвижности макромолекулы и используется при уточнении ее структуры; он особенно ценен тогда, когда количество рентгеноструктурных данных ограничено.

Из всех спектроскопических методов наиболее эффективным для изучения конформацни моно-, олиго- и полинуклеотидов в растворе является ЯМР. Результаты этих исследований совместно с кристаллографическими данными и классическими расчетами потенциальной энергии позволяют получить наиболее полное представление о структурных особенностях молекул.

ГЛАВА 4

Структура и конформационные свойства оснований, фуранозных Сахаров и фосфатных групп

Поскольку геометрия оснований, нуклеозидов и нуклеотидов и их конформационные свойства тесно связаны между собой, в этой главе мы будем рассматривать одновременно и те и другие. Мы опишем основные структурные свойства строительных блоков нуклеиновых кислот, знание которых является необходимым условием для интерпретации структуры олиго- и полинуклеотидов. Структуре и конформации нуклеозидов и нуклеотидов посвящено несколько обзорных статей; в них описаны результаты кристаллографических исследований [35, 166 169] и их детальный анализ [170-172], спектроскопические данные [130, 135, 144, 173-178], а также классические и квантовохимические расчеты потенциальной энергии [70, 179-182].

Основные физико-химические и биохимические свойства нуклеозидов и нуклеотидов рассмотрены в нескольких монографиях и книгах [123-125, 183-190].

4.1. ГЕОМЕТРИЯ ОСНОВАНИЙ