Биологический каталог




Принципы структурной организации нуклеиновых кислот

Автор В.Зенгер

в случае правой 1сверхспирали и положителен в случае левой (см. рисунок в дополнении 19.3).

Дополнение 19.3

Определение ранзинга

Словесное определение знака сверхспирали ДНК такое же, как и в случае двойной спирали (т. е. связано с понятием левого и правого винта). Однако знак, приписываемый райзингу Wr, который используется при описании сверхспиралей, определяется по-другому. Это требует некоторых пояснений, для которых мы воспользуемся рисунком, приведенным ниже.

Предположим, что резиновую трубку, которую мы будем использовать в качестве модели двойной спирали ДНК, намотали на цилиндр так, что образовалось N левовинтовых витков. Свободный конец трубки во время наматывания мог свободно вращаться. После этого концы трубки соединили и удалили цилиндр. Трубка сразу же перейдет в другую топологическую конфигурацию, которая будет представлять собой аналог закрученной на себя двойной спирали (= сверхспирали). У этой сверхспирали угол а2 (см. рисунок) будет больше, чем угол а, у исходной левовинтовой структуры, при этом в сверхспирали «образуется» приблизительно N/2 витков. На самом деле мы видим на рисунке не N/2 (т.е. не 4), а только 3 витка, потому что искривление осевой линии трубки (райзинг) при сворачивании ее в сверхспираль частично компенсируется внутренним кручением и появлением изгибов на обоих концах сверхспирали. Самое удивительное, что получившаяся сверхспираль оказывается правой. Тем не менее, поскольку мы начинали с левого винта, определим число сверхвитков спирали отрицательной величиной, — N/2 [1357, 1365]. При подсчете райзинга Wr учитываются все точки пересечения, поэтому в нашем примере Wt = — 8 (см. подпись к рисунку).

. Наша трубка (ДНК) при образовании сверхспирали раскручивается на N витков, Д7^, = — N. Вы можете это легко проверить с помощью следующего эксперимента. Возьмите резиновую трубку за два конца и вращайте конец, который вы держите в правой руке, по часовой стрелке («по правому винту»). Это будет соответствовать раскручиванию двойной спирали ДНК (в чем вы можете легко убедиться, если возьмете не шланг, а скрученную в «правую спираль» веревку или телефонный шнур). Если сделать N вращений (т.е. повернуть конец трубки на угол N ¦ 360°), то порядок зацепления нашей модели ДНК уменьшится: ALk = — N. Теперь соедините концы трубки и дайте ей возможность принять равновесную, сверхспиральную форму. Образовавшаяся сверхспираль будет в точности идентична той, которая получалась ранее, в результате наматывания трубки на цилиндр (см. рисунок).

Эти опыты моделируют закручивание молекулы ДНК вокруг гистоновых октамеров в нуклеосомах. В разд. 19.4 был описан эксперимент, в котором закрученную в левую спираль вокруг гистонового октамера кольцевую ДНК переводили в релаксированное состояние при помощи топоизомеразы I. После удаления гистонов «недокрученная» ДНК сворачивалась в правую сверхспираль.

488

Глава 19

Причину образования этой сверхспирали можно понять, обратившись к уравнению (19.1). Поскольку ДНК стремится сохранить В-форму, значение ДТ^, будет близко к нулю. Поэтому недокручивание (— Al-k) должно компенсироваться изменением райзинга (— AWr), что эквивалентно образованию правой сверхспирали.

Определение райзинга. Предположим, что резиновая трубка свободно, без напряжения, намотана на цилиндр, образуя при этом 8 левых витков. Если соединить концы этой трубки и удалить цилиндр, она примет форму правой спирали с 8 точками пересечения (из-за концевых эффектов в этом примере получится только 6 пересечений). Поскольку исходная спираль была левой, райзингу приписывают отрицательное значение Wr= — 8, хотя сверхспираль, которая получается после удаления цилиндра, является правой [1362].

Более высокие уровни структурной организации ДНК

489

I Рассмотрим теперь два примера, показанные на рис. 19.11. Если кольцевая ДНК сохраняет плоскую конфигурацию, то изменение порядка зацепления

ALk = ATW + А И; (19.2)

компенсируется лишь изменением кручения 7^,, поскольку в этом случае и Wr и AWr равны нулю. Необходимое изменение 7^, достигается либо путем монотонной модификации всех витков спирали, либо (с сохранением В-формы ДНК) в результате разрушения нескольких пар оснований. С другой стороны, если параметр 7^, не меняется (А 7^, = 0), то

ALk = AWj,

т.е. изменение порядка зацепления почти полностью переходит в сверхспиральный райзинг Wr (почти, потому что при образовании сверхспирали немного изменяется и величина 7^, [1362]). В примере, приведенном на рис. 19.11, ДНК раскручивают, при этом Lk уменьшается и, следовательно, ALK отрицательно (ALK = — 6).

Если теперь замкнуть ДНК в кольцо и отпустить его, оно примет форму правой сверхспирали с отрицательным райзингом (— AWr) (см. дополнение 19.3). Если, наоборот, перекрутить двойную спираль (т.е. внести положительное ALK)> то после замыкания в кольцо образуется левая сверхспираль, число витков которой определяется положительным райзингом AWr.

В альтернативном способе описания используются другие обозначения — а, Р, т, причем

а = р + т. (19.3)

Здесь число топологических витков а эквивалентно Lk, а р и т эквивалентны Tw и Wr соответственно. При описании степени сверхспирально-сти часто используют понятие плотности сверхвитков а = т/р. Эта величина дает грубую оценку числа сверхвитков на 10 пар оснований; для ДНК, выделенной из клеток и вирусных частиц, а обычно равно — 1/15, или -0,06 [1353, 1363, 1364].

Z-форма ДНК имеет особое значение для сверхспирализации. Если У В-ДНК перевести один виток в Z-форму, т.е. преобразовать правый виток в левый, то у оставшейся части молекулы в идеальном случае (в •отсутствие концевых эффектов) кручение 7^, увеличится на 2, АТ^, = — 2. Так как Lk у кольцевой замкнутой молекулы ДНК является топологическим инвариантом, при изменении 7^, должен соответствующим обра-' зом измениться и райзинг: А= 2. Это означает, что переход В ?± Z да-'же на небольшом участке молекулы будет оказывать очень сильное влияние на макроскопическую топологию сверхспиральной ДНК и поэтому, возможно, используется клеткой в процессе экспрессии генов (см. 'также гл. 12).

Как экспериментально установить наличие сверхспирализации ДНК?

490

Глава 19

Прямой путь обнаружения сверхспиральных структур-это, конечно, их визуализация с помощью электронной микроскопии [1350, 1362].

Косвенный но тем не менее очень чувствительный метод, пригодный для исследования ДНК в водном растворе, основан на интеркаляции молекул антибиотиков или красителей в двойную спираль кольцевой ДНК. Как описано в гл. 16 и показано на рис. 16.3. при некоторой концентрации интеркалятора наблюдается полная компенсация отрицательных сверхвитков (т.е. правой сверхспирализации ДНК) и дальнейшее добавление интеркалятора приводит к образованию сверхспирали противоположного знака (а значит, и к изменению знака Щ).

Обратимся теперь к уравнению (19.1) и вновь напомним, что значение LK все время остается постоянным, поскольку мы имеем дело с кольцевой замкнутой молекулой ДНК. Каждая интеркалированная молекула раскручивает двойную спираль ДНК на угол ~ 26° [1350, 1362, 1365]. Уменьшение кручения, —Л7^,, должно компенсироваться соответствующим увеличением (отрицательного)' райзинга AWr (поскольку Lk = const). Поэтому при некоторой концентрации интеркалятора W, становится равным 0 и ДНК принимает форму расправленного кольца без сверхвитков; дальнейшее добавление интеркалятора приводит к тому, что 7^, становится меньше 1* и, следовательно, параметр Wt становится положительным. Это означает, что ДНК теперь образует сверхспираль противоположного знака (левую). На первый взгляд кажется парадоксальным, что исходная сверхспираль, образованная из-за «недокручивания» ДНК, компенсируется при дополнительном раскручивании двойной спирали под действием интеркаляторов. Однако это легко понять, если промоделировать процесс с помощью гибкой резиновой трубки.

Дискретность параметра порядка зацепления можно проверить при помощи электрофореза в агарозном геле [1365]. Этим методом разделяют молекулы ДНК одинаковой длины (и заряда) по их форме и степени компактности. Если обработать кольцевую ДНК топоизоме-разой I при разной концентрации этидия, который в данном случае используется в качестве интеркалирующего агента, получится набор кольцевых молекул с различным порядком зацепления При электрофорезе таких молекул получается набор хорошо разделяющихся дискретных полос. Сверхспирализацию ДНК можно обнаружить также с помощью некоторых ферментов, которые взаимодействуют преимущественно со сверхспиральной ДНК [1350-1352].

Другие виды топологической изомеризации, осуществляемые при помощи ферментов. Кроме релаксации и «закручивания» двойной спирали ДНК в результате действия топоизомеразы I могут происходить и другие изменения в топологии молекулы ДНК, в том числе одноцепочечной.

При взаимодействии топоизомеразы I с одноцепочечной кольцевой или линейной ДНК могут образовываться топологические узлы, пока-

Более высокие уровни структурной организации ДНК 491

Рис. 19.12. Схематическое изображение структур, образующихся при действии различных топоизомераз на двухцепочечную (жирные линии) и одноцепочечную (тонкие линии) ДНК [1375]. Символами «+» и « —» на схеме Б обозначены комплементарные цепи ДНК. Реакция В может проходить и с двухцепочечными | ДНК. В ходе реакции Г образуются катенаны.

занные на рис. 19.12, причем реакция образования этих узлов обратима. Аналогичным образом двухцепочечную кольцевую ДНК можно разделить на составляющие одноцепочечные кольца, из которых опять можно собрать исходную структуру. Наконец, возможно образование довольно экзотической структурной формы, которая состоит из замкнутых, продетых одна в другую кольцевых молекул. Молекулы ДНК в такой форме называют катенанами. Катенаны удается получить in vitro, они были выделены также из некоторых организмов [1354, 1366]. Особенно большое количество конкатенантных молекул ДНК (до 50%) можно выделить из митохондрий L-клеток млекопитающих (когда эти клетки находятся в стационарной фазе роста), обрабатывая клетки ци-

492

Глава 19

клогексимидом или переводя их в среду, не содержащую аминокислот [1366-1368].

Сверхспиральные кольцевые ДНК имеют определенную третичную структуру. Эксперименты по ультрацентрифугированию и светорассеянию, а также электронно-микроскопические исследования сверхспиральных кольцевых замкнутых ДНК показывают, что эти молекулы могут образовывать не только регулярную перекрученную сверхспираль, но и структуры, по форме напоминающие звезду [1311, 1369 1371]. Вероятность образования таких пространственных конфигураций зависит от ионной силы; они особенно стабильны в условиях, характерных для клеточного ядра [1371].

Формирование подобных структур, по-видимому, обусловлено гетерогенностью нуклеотиднои последовательности ДНК, и они образуются даже при относительно небольшой разнице в энергиях. Согласно распределению Больцмана, даже при разнице в энергии 2 ккал ¦ моль ~ 1 энергетически более выгодную конформацию будут иметь 98% молекул [1370]. Возможно, лепестки «звезды» образуются преимущественно из АТ-богатых участков, поскольку они более «гибкие». С другой стороны, палиндромные последовательности (дополнение 18.1), которые могут образовывать структуры типа гиреровских деревьев (дополнение 18.2), вероятно, формируют дополнительные ветви [1368], особенно в случае «недокрученной» ДНК с отрицательной сверхспиральностью, у которой таким образом может частично сниматься напряжение [1372]. Вопрос о том, имеют ли палиндромные последовательности (особенно длинные палиндромные последовательности, найденные в геноме эукариот [1373, 1374]) в условиях клеточного ядра обычную структуру или они образуют петли, которые могут служить «сигналами» для определенных белков, все еще является предметом дискуссий. Следует упомянуть также о пространственных структурах типа крестообразных деревьев, в которых два палиндромных двухцепочечных участка свертываются вместе, образуя четырехцепочечную сверхспираль [1375]. В принципе образование таких легко распознаваемых характерных структурных элементов возможно, однако их биологическое значение и сам факт существования до сих пор находятся под вопросом.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ

Для двухцепочечной ДНК (но не РНК) известно несколько форм с высоким уровнем структурной организации. Они образуются путем простой агрегации в присутствии двухвалентных катионов, таких, как Mg2 +, полиаминов или основных полипептидов, и представляют собой компактные структуры, которые могут свертываться в тороиды. При высокой концентрации соли и в присутствии макромолекул типа поли-этиленоксида ДНК конденсируется в форму, которую называют \|/-ДНК; переход в эту форму является кооперативным и обратимым. Полученные при обработке ультразвуком фрагменты ДНК длиной 2000 А при постепенном увеличении концентрации спирта кристалли-

Более высокие уровни структурной организации ДНК

493

зуются, хотя получающиеся кристаллы и не пригодны для дифракционных исследований. Эти кристаллы по толщине равны длине одного фрагмента ДНК; подобные структуры образуют и другие полимеры при многократном складывании.

В клеточном ядре ДНК компактизуется с помощью четырех видов (различных гистонов. Гистоны-это основные белки, их мол. масса равна 14000-22000. При агрегации 8 молекул гистонов (по 2 молекулы гисто-на каждого типа) образуется глобулярный гистоновый октамер, вокруг которого обвивается ДНК длиной 146 пар оснований, образующая 13/4 [левых сверхвитка. Такая структура называется нуклеосомным кором. С ДНК связан еще один гистон, HI, скрепляющий нуклеосомный кор, который вместе с гистоном HI образует нуклеосому. Цепь ДНК с ну-клеосомами, которые разделены сегментами ДНК длиной 40 100 пар оснований, по виду напоминает нитку бус (волокно-100 А). Эта структура образуется при низкой ионной силе и называется хроматином. При увеличении ионной силы или при добавлении в систему двухвалентных катионов типа Mg(II) нить компактизуется в «соленоидальную» форму с 3-6 нуклеосомами на виток, скрепленными друг с другом с помощью гистонов HI. Такой соленоид (или волокно диаметром 300 А) закручивается в еще более конденсированную спиральную структуру, образуя хромосому. Хромосомы человека содержат двухцепочечную ДНК общей длиной около 2 м и имеют хорошо известную Х-образную форму; образование такой формы обеспечивается белковым каркасом, а конденсация ДНК ее взаимодействием с гистонами.

В хромосомах и кольцевых замкнутых (плазмидных) ДНК концы двухцепочечной молекулы фиксированы либо путем образования обычной ковалентной связи, либо с помощью определенной упаковки молекулы. Имеется класс ферментов-так называемые топоизомеразы-которые закручивают молекулу ДНК и создают в ней сверхвитки (что эквивалентно запасанию энергии) или, напротив, сбрасывают эти сверхвитки. С их помощью можно изменять общую структуру ДНК, играющую важную роль в экспрессии генов. Топология замкнутой ленты (ДНК) описывается с помощью соотношения L^ = Wr+ Tw, где порядок зацепления Lk (в случае ДНК) определяет, сколько раз одна цепь молекулы обвивает другую. П

страница 59
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79

Скачать книгу "Принципы структурной организации нуклеиновых кислот" (9.68Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.08.2019)