сго-репрессора фага X, содержащую предполагаемое место связывания с ДНК, сравнивали с соответствующими последовательностями cro-репрессора фага 434, белков cl и ell фага X, репрессорного белка фага Р22 сальмонеллы и /ас-репрессора [1279d]. Для аминокислотных последовательностей и для нуклеотидных последовательностей соответствующих генов была обнаружена довольно значительная гомология. Это позволяет предположить, что N-концы всех этих репрессоров сходны также и по своей вторичной структуре и имеют общего дшественника. Если эта гипотеза верна, получают объяснение экспе-енты по химической защите и генетической модификации, которые оводились с /ас-репрессором. Кроме того, становится понятно, поче-тетрамер /ас-репрессора связывает одновременно два операторных стка.

Белок, активирующий катаболизм (БАК): с правой или с левой спиралью В-ДНК связываются его а-спиральные участки [1280, 1280а]? Если его- и Х-репрессоры подавляют транскрипцию ДНК, то БАК, напротив, включает оперон, к которому он специфичен, используя при этом в качестве аллостерического эффектора циклический AMP. БАК состоит одной полипептидной цепи длиной в 201 аминокислотный остаток, активной форме он представляет собой димер, который был закристаллизован в комплексе с эффектором циклическим AMP. Пространственная структура комплекса БАК-сАМР гораздо сложнее, чем структура cro-репрессора. Молекула БАК состоит из двух структурных доменов. Большой домен, расположенный на N-конце, включает две короткие а-спирали А и В, антипараллельную Р-структуру, уложенную "осьмицепочечный «Р-roll» («рулет»), и протяженную спираль С, которая соединяет большой N-концевой домен с малым С-концевым. Малый домен состоит из спиралей D, Е и F и С-концевого участка, который плохо виден на карте электронной плотности.

Две молекулы БАК в димере располагаются почти параллельно .друг другу и удерживаются вместе благодаря взаимодействию длинных С-спиралей. Молекулы связаны друг с другом псевдоосью 2-го порядка (рис. 18.18), а участок ДНК, с которым связывается БАК, содержит па-линдромную последовательность (дополнение 18.1). Поэтому естественно предположить, что в структуре комплекса две оси 2-го порядка совпадают. Если следовать этому предположению, легко заметить, что структурными элементами белкового димера, которые могли бы взаимодействовать с двойной спиралью ДНК, являются F-спирали-их длина равна ~ 22 А, а расстояние между ними ~ 34 А. Однако угол наклона этих спиралей к линии, соединяющей их центры, составляет 65-70°, о значительно отличается от величины ~ 32', характерной для накло-цепей в В-ДНК. Это может означать, что БАК связывается не с правой, а с левой двойной спиралью В-ДНК, подобной той, которая была предложена на основании теоретических расчетов [1281, 1281а]. Такая модель комплекса не только удовлетворяет стереохимическим крите-

Взаимодействия между белками и нуклеиновыми кислотами 457

риям, но и объясняет соответствующие генетические и химические данные [1280].

Если эта модель верна, то отсюда следует, что сАМР, действуя как аллостерический эффектор, задает относительную ориентацию двух субъединиц БАК в димере. Его удаление должно изменить общую 'структуру димера БАК, и следовательно, разрушить ДНК-связывающий центр. Возможно, изменение знака спирали ДНК при связывании с БАК •активирует процесс транскрипции за счет локальной дестабилизации ((или выплавления) двойной спирали В-ДНК внутри промоторной области. Это согласуется с данными о том, что БАК действует наиболее эффективно тогда, когда он может снимать отрицательные сверхвитки у кольцевой замкнутой ДНК, т.е. именно в том случае, когда можно предполагать локальный переход правой формы двойной спирали ДНК в левую. Замена правого витка на левый уменьшает кручение Tw на — 2 и (поскольку мы говорим о кольцевой замкнутой ДНК) увеличивает райзинг Wt (отрицательный) на +2, что отвечает процессу релаксации отрицательно сверхспирализованной ДНК (определение Tw и Wr см. 'в разд. 19.7).

В более поздней работе [1281b] было высказано предположение, что на самом деле две симметрично расположенные F-спирали димера БАК 'связываются не с двумя последовательными участками желобка одной и той же (левой) двойной спирали ДНК, а с желобками (правых) ДНК, расположенных параллельно друг другу. Две параллельные спирали 'ДНК могут быть частью левой сверх спирали, подобной той, которая "показана на рис. 19.3, только более компактной (т. е. с тесно примыкающими сверхвитками), что находится в соответствии с результатами электронно-микроскопических исследований. Общая топология сверхспиральной ДНК в такой структуре должна быть иной; это также согласуется с упомянутыми выше экспериментальными данными о том,

Рис. 18.18. А. Молекулярная структура белка, активирующего катаболизм (БАК); а-спирали изображены в виде цилиндров, а Р-складчатый «рулет», представляющий собой место связывания сАМР,-в виде стрелок. БАК образует димер, при этом две молекулы белка оказываются связанными друг с другом осью симметрии 2-го порядка (идущей почти вертикально), межмолекулярный контакт возникает главным образом из-за взаимодействия длинных спиралей С, которые в димере располагаются почти параллельно и близко прилегают друг к другу. Б. Модель комплекса димера БАК с левой спиралью В-ДНК (отличной ОТ Z-ДНК, о которой идет речь в гл. 12); а-спирали белка F располагаются в главном желобке ДНК. Левая В-ДНК построена по координатам, приведенным в работе [1281]; спираль ДНК наклонена на ~65° к вертикали так, что спирали F димера БАК лежат в плоскости рисунка. Одна молекула димера изображена жирными линиями, другая-пунктиром. Более поздние данные показывают, что эта модель может быть неверна и в действительности БАК связывается с правой ДНК (см. также [1281b]). [1280].

458

Глава 18

что БАК наиболее эффективен, когда происходит (частичная) релаксация кольцевой замкнутой ДНК. Пока вопрос о том, каким образом БАК активирует РНК-полимеразу - путем прямого белок-белкового взаимодействия или благодаря локальным изменениям конформацни ДНК,- остается открытым. Если причиной активации является изменение коиформации ДНК, то БАК действует как аллостерический эффектор топологических изменений сверхспиральной ДНК, тогда как репрес-соры (например, его) можно считать отрицательными аллостерическими эффекторами [1281Ь].

Сейчас трудно сказать, какая из рассмотренных моделей связывания БАК с ДНК верна (возможно, что неверны обе модели). Однако более правдоподобной кажется модель связывания БАК с правой спиралью ДНК; модель комплекса БАК с левой двойной спиралью более спекулятивна и получила поддержку главным образом потому, что с появлением Z-ДНК левые спирали «вошли в моду». Размышления на эту тему привели бы нас к обсуждению философской проблемы интерпретации научных результатов, которая лежит вне рамок этой книги и которую мы оставляем читателю в качестве домашнего задания.

Структурный мотив из двух а-спиралеи в белках, связывающихся с двойной спиралью ДНК. Сравнение пространственной структуры сго-и Х-репрессоров и БАК показывает, что в субъединице каждого белка присутствует один и тот же структурный мотив, состоящий из двух а-спиралей, которые, по-видимому, связываются с ДНК [1281]. Эти спирали-2 и 3 в репрессорах и Е и F в активаторе БАК - выступают над поверхностью глобулы соответствующих белков. Если смотреть на белки со стороны ДНК, то мы увидим, что к N-концам а-спиралей, связывающихся в главном желобке ДНК (спирали 3 в репрессорах и спираль F в БАК), присоединены другие короткие спирали, которые располагаются за данными спиралями и под прямым углом к ним. Это спирали 2 в репрессорах и спираль Е в БАК. Было высказано предположение, что наличие такого структурного элемента характерно для всех белков, связывающихся с двойными спиралями ДНК; об этом же свидетельствует и гомологичность последовательностей ряда репрессоров [1279с, 1279d]. Основное структурное отличие репрессоров от активатора БАК состоит в неодинаковой ориентации этих спиралей, как было описано, а также в их локализации в белковой цепи (на N-конце у репрессоров и на С-конце у активатора).

Продукт гена 5 фага fd кооперативно связывается с одноцепочечной ДНК. Расплетающие белки. И в живых организмах, и in vitro экспрессия ДНК сопровождается раскручиванием двойной спирали, которое облегчает связывание ферментов с ДНК, выступающей в качестве субстрата. Расплетание двойной спирали и стабилизация одноцепочечной ДНК легче всего происходят тогда, когда полинуклеотидные цепи образуют комплексы с ДНК-связывающими белками. К этому широко распространенному классу белков относится белок гена 5 фага fd. Он представляет собой полипептидную цепь длиной 87 аминокислотных остатков,

Взаимодействия между белками и нуклеиновыми кислотами 459

которая продуцируется в количестве ~ 75 ООО копий на инфицированную клетку Е. coli [1282].

С помощью рентгеноструктуриого анализа кристаллов белка гена 5 установлено, что молекула белка имеет Т-образную форму и целиком состоит из Р-слоев (рис. 18.19,/4) [1190, 1190а]. Первые десять N-концевых остатков образуют короткую Р-цепь; за ней следует большая «ДНК-связывающая петля» (остатки 15-32), к которой присоединена «комплексная петля» (остатки 33-49). Образовав еще одну короткую Р-цепь (остатки 52-59), полипептидная цепь переходит от горизонтальной перекладины буквы Т к «ножке»; здесь образуется вертикальный стебель из большой «диадной петли» (остатки 61-82).

В растворе, в кристаллическом состоянии и в комплексе с ДНК белок гена 5 существует в виде димера; при этом две молекулы белка связаны друг с другом осью симметрии 2-го порядка, расположенной так, что две «диадные петли» в димере слипаются (рис. 18.19, Б), а перекладины двух букв Т оказываются ориентированными антипараллельно. Вдоль перекладины Т располагается ДНК-связывающий канал шириной ~ 10 А и длиной ~ 35 А, образованный остатками 15-32. Длина канала оказывается достаточной для того, чтобы в нем разместился фрагмент одноцепочечной ДНК в ~ 5 нуклеотидов, имеющий растянутую конформацию (рис. 18.19, В). Во впадине канала находится несколько .аминокислотных боковых цепей, которые могут взаимодействовать с расположенной в канале одноцепочечной ДНК, если допустить, что при связывании ДНК происходит незначительная переориентация подвижных боковых цепей в структурной модели белка гена 5. Предполагается, что в комплексе осуществляются два типа взаимодействия: притяжение разноименных зарядов и гидрофобное стэкинг-взаимодействие боковых цепей ароматических аминокислот с основаниями (рис. 18.19, В). Первый тип взаимодействия распространяется на фосфатные группы ДНК и положительно заряженные группы Argl6, 21, 80, J^ys46 и, вероятно, Lys24 и 69; во втором принимают участие остатки Туг26, 34, 41 и Phe73' (штрихом отмечен остаток из симметрично связанной субъединицы димера) [1190а, 1283-1285].

Повышенное содержание остатков лизина и аргинина во впадине предполагает, что белок в первую очередь «узнает» отрицательно заряженный сахарофосфатный остов ДНК, который связывается с поверхностью белковой молекулы за счет притяжения между разноименными зарядами. Связывание сопровождается конформационными изменениями, в результате которых основания в стопке расходятся, а боковые це-|Пи ароматических аминокислот поворачиваются в положение, из кото-¦эого они могут «проскользнуть» между основаниями, как закладки ежду страницами книги, и тем самым скрепить комплекс белка с ДНК ~зд. 18.3). В кристалле, как и в растворе, белок гена 5 присутствует виде димера. При связывании с двойной спиралью этот димер, вероятно, сначала разделяет антипараллельные цепи ДНК, а затем связывается с ними; связывание стимулирует образование линейных агрега-

460

Глава 18

Взаимодействия между белками и нуклеиновыми кислотами

461

В

TYR 41

Рис. 18.19. Схематическое изображение полипептидной цепи белка гена 5 фага jd. А. Мономер белка гена 5. Т-образная молекула состоит исключительно из (3-цепей; «ДНК-связывающую петлю» образуют остатки 15-32, «диадную петлю»-остатки 61-82. Б. Белок гена 5 образует димер, при этом две молекулы оказываются связанными осью симметрии 2-го порядка и две «диадные петли» примыкают друг к другу, а перекладины букв Т и соответственно две ДНК-связывающие петли располагаются в антипараллельной ориентации. Приведена модель связывания одноцепочечной ДНК «ДНК-связывающей петлей». В. Цепь пентануклеотида (dA)5, представленная в той же ориентации, что и на рис. Б; иоказаны участвующие во взаимодействии с ДНК боковые группы белка. Боковые группы всех ароматических аминокислот участвуют в стэкинг-взаимодей-ствии с основаниями, при этом Туг26 и два аденина образуют структуру типа «сэндвич». Рисунки любезно предоставлены авторами работы [1190а] до опубликования статьи.

462

Глава 18

тов белковых димеров вдоль цепей ДНК. Эти агрегаты образуют новую спиральную структуру с диаметром ~ 100 А, шагом 80-90 А и с шестью димерами белка на виток, которые составляют белковый кор. В коре проходят две отдельные цепи ДНК [1190, 1286]. Они располагаются на расстоянии 21-23 А от оси (по данным нейтронного рассеяния [1287]), и это означает, что ДНК находится не на периферии белковой спирали, а уложена в какую-то выемку внутри. Продольная агрегация белков является высококооперативным процессом, способствующим эффективному расплетанию двойной спирали ДНК.

18.7. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПРЕАЛЬБУМИНА С ДНК. ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ

Рентгеноструктурный анализ первого хорошо охарактеризованного гор-мон-связывающего белка-преальбумина плазмы крови человека, связывающего гормон щитовидной железы,-показал, что этот белок состоит из четырех идентичных субъединиц, каждая из 127 аминокислотных остатков, которые образуют тетраэдр. Структурная модель преальбумина предполагает наличие поверхности, которая по размеру и форме комплементарна фрагменту В-ДНК длиной 10—12 пар оснований. По обе стороны от полуцилиндрического желобка выступают две спирали (которые при связывании с ДНК могли бы выполнять роль «щупалец») [1288]. Дно желобка выстилает пара симметрично расположенных р-слоев, а «наружные щупальца» хорошо укладываются в главный желобок двойной спирали ДНК.

Комплекс между этим белком и ДНК (если он действительно существует) также должен обладать симметрией 2-го порядка, о которой говорилось ранее при рассмотрении других ДНК-белковых комплексов, и, следовательно, участок связывания на ДНК должен представлять собой палиндром (дополнение 18.1). Молекулярная модель комплекса ДНК с преальбумином была построена без детальной подгонки белковых боковых цепей под модель ДНК; тем не менее видно, что 10 остатков лизина, 4 остатка гистидина, 8 остатков глутаминовои кислоты и 6 аспарагиновой находятся в таких положениях, что в принципе они могли бы взаимодействовать с ДНК.

Хотя эта модель кажется весьма правдоподобной, однако доказательств того, что преальбумин взаимодействует с ДНК, до сих пор не получено. Более того, некоторые экспериментальные данные свидетельствуют о том, что связывания преальбумина с ДНК не происходит [1289]. Если обратиться к расчетам потенциалов поверхностей