между РНК в комплексе с полилизином и свободными двойными спиралями РНК; образованию таких сшивок должны способствовать наличие дополнительной гидроксиль-ной группы 02-Н и А-конформация.

В комплексе с моно-, олиго- или полиаргинином ДНК остается в В-форме при всех значения относительной влажности-от 0% до насыщения [1238, 1240]. Однако при образовании комплекса с полилизином происходят конформационные изменения двойной спирали ДНК. Природа этих изменений пока до конца не установлена; это может быть и переход в А-, и переход в С-форму [1238, 1245, 1246], и образование

430 Глава 18

Дополнение 18.2 Олнгоаргнннны в аминокислотной последовательности протаминов

Протамины-это небольшие белки с мол. массой около 4200. Из-за наличия большого числа аргининовых остатков они проявляют высокую основность и очень прочно связываются с ДНК и РНК. В аминокислотной последовательности протаминов аргинины собраны в кластеры длиной от четырех до шести остатков; при этом пролиновые остатки располагаются в таких положениях, что разбивают последовательность на почти правильные интервалы. Это позволяет предположить, что вторичная структура протаминов состоит из четырех а-спи-ралей.

В приведенной ниже таблице известные последовательности протаминов представлены таким образом, чтобы положения большинства аргининов (обозначенных символом «+») совпадали. Использованы следующие сокращения: А- аланин, Е-глутаминовая кислота, G-глицин, I-изо лейцин, Р-пролин, Q-глутамин, S-серии, Т-треонин, V-валин, Y- тирозин. Предполагается, что протамины имеют вторичную структуру, показанную внизу, т.е. состоят из четырех а-спиралей, соединенных подвижными шарнирами. Аргинины обозначены черными точками, пролины и глицины-буквами Р и G (из [1252]).

Сальмин AI Р + ¦ ¦ + S S S + Р V + 4 * + + P+VS+++* 4 4 G G + 4 4 4

Иридии Ка> Р + + + + S S S ¦ Р V + 4 + + P++VS+++ ¦ 4 4 G G ¦ 4 4 4

Иридин [(в) р + ¦ + ¦ + ¦ s S S ¦ Р I + + * + + P++VS+++ 4 4 G G ¦ 4 4 4

Иридин [[ Р ¦ ¦ + ¦ S S S ¦ Р V ¦ + + ¦ A++VS+++ 4 4 + 6 G 4 4 4 4

Тиннин Y1 Р + + + + Е A S ¦ Р V ¦ + ¦ ¦ ¦ Y++STAA+ 4 4 4 4 V V * 4 4 4

Тиннин Y2 Р + + + + 0 A S + Р V ¦ + + + + Y*+STAA* 4 4 4 4 V V 4 4 4 4

Тиннин 11 Р ¦ * * ¦ ¦ S S + Р V ¦ ¦ ¦ + Y ¦ + S Т V А + ¦ ¦ + + V V 4 4 4 +

Тиннин 12 Р ¦ + + ¦ ¦ S S + Р V + + + + + Y++STAA+ 4 4 4 4 V V + 4 4 4

Клупин г р ¦ ¦ + ¦ S ¦ ¦ A S + Р V * * ¦ ¦ P++VS+++ 4 А ¦ 4 4 4

Клупин YI А ¦ ¦ + + S S S + Р 1 + + + + Р+++ТГ+* 4 ¦ AG* 4 4 4

Клупин Ш Р + + ¦ т ¦ ¦ a S + Р V + + ¦ * P++VS++* * А + 4 4 4

Спираль А Спираль В Спираль С Спираль О

Взаимодействия между белками и нуклеиновыми кислотами 431

искаженной В-формы [1241]. Аналогичное поведение ДНК наблюдается и в случае комплекса с полигистидином [1247].

Почему полиаргинин и полилизин по-разному влияют на структурные свойства ДНК в комплексе? Возможно, дело в том, что комплексы фосфатов с концевыми амино- и гуанидиновыми группами имеют разную геометрию (см. разд. 18.2) и что аргинин связывается с ДНК сильнее, чем лизин; это согласуется также с результатами, полученными методом равновесного диализа [1248].

Взаимодействие ДНК и одноцепочечных полинуклеотидов с боковыми группами ароматических аминокислот. Гипотеза «книжной закладки». Для этих систем имеются только спектроскопические и гидродинамические данные. Чтобы оценить возможность взаимодействия боковых групп ароматических аминокислот основных пептидов (гистонов, прота-минов) с двойной спиралью ДНК, изучали комплексы двух- и одноцепочечных полинуклеотидов с модельными ди- и трипептидами, у которых одна ароматическая аминокислота присоединена (у дипептидов) или с двух сторон окружена (у трипептидов) остатками аргинина или лизина [1195, 1249-1251]. В связывании с одноцепочечными полинуклеотидами в основном участвуют заряженные концевые группы пептидов и боковая цепь ароматической аминокислоты, которая вступает в стэкинг-взаимодействие с основаниями. В случае poly (А) константы связывания уменьшаются в следующем ряду: триптофан, тирозин, фенилаланин 1250].

Двойные спирали ДНК при образовании комплексов с боковыми группами ароматических аминокислот проявляют определенную специфичность. Быстрое и сильное электростатическое связывание (Ксв ~ ~ 105 моль-л ~*) сопровождается медленной и слабой (Ксв~ ~ ДО2 моль • л _ *) интеркаляцией ароматической боковой цепи между парами оснований [1251а]. Так как ароматический остаток проникает между парами лишь частично, он действует как своего рода клин и создает изгиб в двойной спирали [1195, 1251] (рис. 18.8). Такая «закладка» чаще располагается между АТ-парами, для которых, как отмечалось в гл. 6, характерен менее сильный стэкинг, чем для GC-nap. Для пептидов ряда Lys—Х-амид, где Х-разные ароматические остатки, наблюдается и специфичность другого типа-специфичность к виду остатка X, которая возрастает в ряду триптофан, фенилаланин, тирозин, лейцин [1251].

• В описанных комплексах существенно повышается температура плавления одно- и двухцепочечных полинуклеотидов [1195, 1249-1251]. Этот неожиданный результат (по крайней мере для двухцепочечных ДНК), вероятно, означает, что энергетические потери, связанные с образованием излома, который должен понижать 7^,, с избытком компенсируются выигрышем в энергии, обусловленным взаимодействиями типа «заряд-заряд» между фосфатами и положительно заряженными боковыми группами аминокислот.

Взаимодействие между двойной спиралью и а-спиралью в комплексе тРНК с протаминами. Когда протамин Al из спермы лосося, который

LYS

+ *

LYS

LYS

LYS

LYS

LYS

Рис. 18.8. Схематическое изображение взаимодействия трипептидов Lys—X—Lys (Х-ароматическая аминокислота) с двухцепочечной ДНК [1195]. Первая стадия - быстрое связывание по периферии молекулы ДНК-стабилизируется силами электростатического притяжения. Затем следует медленная частичная интеркаляция боковой цепи аминокислоты X между парами оснований (модель «книжной закладки»), приводящая к появлению изгиба в молекуле ДНК.

Взаимодействия между белками и нуклеиновыми кислотами 433

представляет собой смесь полипептидов со средней мол. массой 4200 (состоящих главным образом из остатков лизина и аргинина; дополнение 18.2), ввели методом диффузии раствора в орторомбические кристаллы дрожжевой тРНКРЬе, оказалось, что он оседает в нишах, образованных минорными желобками соседних молекул тРНК [1252]. Общая структура протамина в комплексе не похожа на вытянутое изображение молекулы, показанное на рис. 18.7, а скорее напоминает а-спираль. Если принять, что последовательность протамина AI характерна для большинства протаминов из спермы лосося, то наиболее удивительным свойством протамина является присутствие в каждом из четырех составляющих его участков по 4-6 аргининовых остатков подряд. Из распределения электронной плотности для комплекса тРНК с протамином можно заключить, что протамин образует четыре короткие а-спирали, состоящие из аргининовых остатков, которые соединены короткими пептидами, содержащими другие аминокислоты.

По периферии коротких а-спиральных участков протамина располагаются гуанидиновые группы аргинина, которые взаимодействуют с фосфатами тРНК. Исходя из геометрии этого комплекса была предложена модель взаимодействия протаминов с ДНК, согласно которой а-спирали протамина располагаются в главном желобке ДНК; однако нельзя исключить и возможности расположения протаминов в минорном желобке. Такое предположение было высказано ранее на основании результатов рентгеноструктуриого анализа волокон [1243, 1244]. Поскольку боковые группы аргинина сильно вытянуты, могут образовываться поперечные сшивки между соседними молекулами ДНК. Это согласуется с той картиной, которая наблюдается на электронных микрофотографиях нуклеопротаминов, где видна сетка из связанных молекул ДНК [1253]. Однако правильность такого предположения была поставлена под сомнение [1254] и предложена другая интерпретация электронных микрофотографий-вокруг гребнеобразного или звездообразного протамина обвивается ДНК в сверхспиральной форме. Сейчас трудно судить, какая из моделей более адекватна; по-видимому, эту дилемму можно решить только с получением новых данных. В любом случае нужно иметь в виду, что взаимодействие а-спирали с двойной спиралью, обнаруженное в комплексе протамина с тРНК, вероятно, имеет место и при взаимодействии белков с ДНК (разд. 18.6).

18.4. ПРИ СВЯЗЫВАНИИ С БЕЛКАМИ НУКЛЕОТИДЫ И ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫЕ НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ ПРИОБРЕТАЮТ ВЫТЯНУТУЮ КОНФИГУРАЦИЮ

Как было показано в предыдущих главах, нуклеотиды в виде мономерных единиц или в составе полинуклеотидной цепи со спиральной упорядоченной конфигурацией имеют «жесткую стандартную» геометрию со следующими характеристиками:

• основание находится относительно сахара в ан/ш-ориентации, т.е.

28-509

434

Глава 18

угол вращения вокруг гликозиднои связи С\—N лежит в интервале -90°<х< - 160й;

• конформация сахара-С2-эндо или С3.-эндо;

¦ торсионный угол у, описывающий поворот вокруг связи С4.—С5., как правило, лежит в области + ск (~ 60°);

• углы вращения р и в вокруг связей С—О лежат в области транс (-180°);

• у правоспиральных полинуклеотидов углы вращения а и ? вокруг связей Р—О лежат в области —ск (~300°).

Все эти структурные особенности в целом сохраняются и тогда, когда двойные спирали ДНК и РНК взаимодействуют с полипептидами, а также при конденсации ДНК в присутствии определенных реагентов или гистонов (гл. 19). Однако ситуация меняется, если с белками связываются мононуклеотиды или одноцепочечные неспиральные полинуклеотиды.

При связывании с активными центрами белков нуклеотиды принимают вытянутую, «открытую» конфигурацию. Когда нуклеотид связывается с активным центром белка, его стандартная структура более или менее сохраняется, за исключением одной важной детали-угол вращения у вокруг связи С4.—С5. меняется от значений +ск до значений —ск или an, что отвечает повороту атома 05. и присоединенного к нему фосфата от фуранозного кольца. Такой поворот «раскрывает» нуклеотид, в результате сахар, основание и фосфатная группа становятся экспонированными, что облегчает взаимное узнавание и связывание нуклеотида и белка.

В табл. 18.3 описаны конформацни нуклеотидов в составе комплексов их с белками, определенные кристаллографическими методами. Лишь в двух случаях угол у лежит в обычном диапазоне + ск: у комплекса GDP с фактором элонгации Ти [1261] и у комплекса никотина-мид-риботидного элемента NAD+ с глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназой омара [1256]. Кроме того, в последнем случае аденин в двух субъединицах из четырех («зеленые» субъединицы в табл. 18.3) находится в син-ориентации, тогда как в остальных молекулах NAD + , указанных в табл. 18.3,-в анти.

В сын-ориентации, по-видимому, находится также центральное основание триплета, связанного с субъединицей вируса табачной мозаики [1266, 1267]. Примечательно, что все 8-бромаденозиновые производные, представленные в табл. 18.3, находятся в анты-ориентации, несмотря на то что 8-бром-замещение усиливает тенденцию пуринового кольца пребывать в сын-ориентации (разд. 4.7). Это означает, что энергия связывания достаточно велика, чтобы компенсировать стерически невыгодные эффекты, связанные с «нты-ориентацией. Тот же фактор, по-видимому, начинает действовать и в том случае, когда принимает необычные значения угол у.

Взаимодействия между белками и нуклеиновыми кислотами 435

18.5. ПРИРОДА НУКЛЕОТИДНО-БЕЛКОВОГО И НУКЛЕИНОВО-БЕЛКОВОГО УЗНАВАНИЯ

Для большинства комплексов, представленных в табл. 18.3, геометрия компонентов определена достаточно хорошо, поэтому можно выделить детали, связанные с их взаимным узнаванием. Однако необходимо помнить, что для белковых структур (в том числе и для тех, которые рассматриваются здесь) разрешение обычно не превышает 2-3 А, а следовательно, такие тонкие детали структуры, как водородные атомы, не выявляются. Тем не менее полученной информации в целом достаточно для того, чтобы воссоздать картину образования нуклеиново-белковых комплексов, отражающую все наиболее интересные структурные особенности. Как мы увидим далее, нуклеотидно-белковые взаимодействия определяются двумя главными факторами: общей топологией партнеров и-более детально-взаимодействиями между нуклеотид ом и атомами остова и боковыми группами белка.

Общая топология нуклеотид-связывающих белков. Домен Россмана. Для ряда белков, которые связываются с нуклеотидными коферментами (NAD +, NADPH) или нуклеозидди- и трифосфатами, характерна определенная топологическая укладка а-спиралей и (J-цепей в области, где происходит связывание нуклеотидов. Нуклеотид-связывающий домен построен из шести цепей параллельного Р-слоя и четырех соединяющих их а-спиралей; структура обладает примерной псевдосимметрией 2-го порядка (рис. 18,9, 18.10). Основываясь на сравнительном анализе холо-ферментных комплексов NAD-зависимьгх дегидрогеназ, Россман и его коллеги высказали предположение об эволюционном консерватизме по крайней мере четырех центральных цепей Р-слоя и связанных с ними а-спиралей, т.е. доменной структуры РаРРар или (РаР)2 [1269, 1270]. Ди-нуклеотид NAD + при связывании располагается около оси 2-го порядка, при этом с каждым РаР-доменом связывается один нуклеотид.

Впоследствии аналогичные РаР-домены были обнаружены также у ряда других белков, связьгоающих нуклеотиды (рис. 18.10), и таким образом возникло представление об общей топологии цепи, предназначенной специально для «узнавания» нуклеотидов. При этом, по существу, имеется в виду следующее: для формирования нуклеотид-связы-вающего центра нужна, во-первых, особая общая пространственная геометрия и, во-вторых, для обеспечения специфичности связывания с этой геометрией должно быть сопряжено определенное расположение некоторых аминокислотных остатков.

Нуклеотидно-белковые взаимодействия непостоянны и многофункциональны. Беглый просмотр табл. 18.4 и рис. 18.11 и 18.12 (где приведены более подробные схемы для нескольких известных нуклеотидно-бел-ковых комплексов) показывает, что нет никаких предопределенных , исключительных и специфических видов взаимодействий между основанием и аминокислотными боковыми цепями. Скорее имеется целая палитра возможностей. Тем не менее при детальном рассмотрении некоторых примеров выявляются и общие тенденции.

28*

Таблица 18.3.

Конформация нуклеотидов в комплексах с белками Бе^к Нуклеотид» Торсионные углы, град Конформа- Ссылка

Лактатдегидрогеназа 5'-АМР 177 178 -91 Су-эндо [1255

Лактатдегидрогеназа ADP , 165 168 - 168 -92 С3--эндо [1255

Лактатдегидрогеназа NAD+ J' 103 - 176 -72 156 -96 С3--эндо [1255

109 178 -87 37 -90 С3--эндо

Лактатдегидрогеназа NAD+-пируват }/ { 109 - 156 - 78 156 -91 С3.