онные методы, и получаемые результаты в этих двух случаях различаются. Разрешение определяется качеством кристалла, и в кристаллографии малых молекул оно обычно бывает лучше 1 А; при этом на карте электронной плотности четко виден каждый атом, и его положение определяется с точностью до 0,002 А. Разрешение для кристаллов глобулярных макромолекул обычно составляет 2-3 А. Это означает, что карта электронной плотности не позволяет локализовать отдельные атомы; видны лишь грубые контуры цепочек из атомов, положение которых после встраивания в эти контуры атомной модели определяется с точностью до 0,25 А. Дифракция на волокнах таких макромолекул, как ДНК, позволяет определить лишь параметры элементарной ячейки и спирали; более полная интерпретация дифракционных данных достигается путем построения молекулярных

Методы

43

моделей с привлечением химических и физических (спектроскопических) данных.

I В кристалле молекулы (иногда и молекулы растворителя) образуют 'регулярную трехмерную матрицу. Основным повторяющимся мотивом является асимметричная часть элементарной ячейки; ее размножение с помощью операций симметрии, свойственных данной пространственной группе, формирует полную элементарную ячейку. Трансляция элементарной ячейки по всем трем направлениям дает кристаллическую Ьешетку (рис. 3.1) [43].

I Конечной целью рентгеноструктурного анализа кристаллов является Локализация всех атомов в асимметричной части ячейки. Для того чтобы определить параметры элементарной ячейки и пространственную Vpynny, кристалл размерами от 0,1 до 0,5 мм устанавливают в вайсен-берговскую или прецессионную камеру и облучают хорошо коллимиро-ванным, монохроматическим рентгеновским пучком. Поворот кристалла (с которым синхронизировано движение кассеты с фотопленкой) последовательно выводит в отражающее положение множество плоскостей кристаллической решетки [уравнение (3.1); дополнение 3.1].

Дополнение 3.1

Некоторые формулы, описывающие закон Брэгга, электронную плотность, структурные факторы и R-фактор

Закон Брэгга. На рентгенограмме, приведенной на рис. 3.2, видно множество отражений, каждому из которых соответствуют свои миллеровские индексы hkl, где h, к и /-целые числа. Каждый рефлекс hkl отвечает семейству параллельных плоскостей кристаллической решетки, находящихся в отражающем положении. Соответствующий угол падения 6/,ы связан с расстоянием d^M между плоскостями законом Брэгга:

2dhklsinehk, = nX,

или

dhki = (nX)l(2sm%kl). (3.1)

В этом уравнении п обозначает порядок отражения hkl. Длина волны X обычно используемого СиКд-излучения равна 1,542 А. Заметим, что чем меньше расстояние dhki (т.е. чем выше разрешение), тем больше угол 6^,. Поскольку на краях дифракционной картины для кристаллов макромолекул (подобных транспортной РНК) отражения отсутствуют (рис. 3.5), разрешение для таких кристаллов {dhkl) обычно не превышает 2-3 А.

Электронная плотность. Рентгеновское отражение hkl фактически представляет собой волну с длиной X, амплитудой | Fhkl | (называемой структурной амплитудой) и фазовым углом Последний нельзя измерить: он определяется с помощью «прямых» либо «паттерсоновских» (метод тяжелого атома) методов. Электронная плотность в точке элементарной ячейки с координатами X, Y, Z рассчитывается по формуле

p(XYZ) = ^-1111 FhklI е<«ше-2щьх+кч+щ (32)

' h к I

44

Глава 3

где V-это объем элементарной ячейки, а тройное суммирование осуществляется по всем измеренным рефлексам, число которых обычно составляет несколько тысяч. Поскольку при расчете электронной плотности элементарную ячейку представляют в виде нескольких тысяч точек XYZ, эта процедура предполагает использование быстродействующих ЭВМ.

Структурный фактор. Полученная карта электронной плотности позволяет определить положения атомов. По координатам и факторам атомного рассеяния fj (они приводятся в таблицах и определяют способность /-го атома рассеивать рентгеновские лучи) рассчитывается структурный фактор Fhkf.

т

Г hkl, расч = 1/;е2га,^+^+'гУе-Тет^.ш (3.3) j=i

Суммирование проводится по всем т атомам элементарной ячейки; Тетрдо представляет собой температурный фактор, учитывающий колебания атомов в кристалле. Эти колебания можно рассматривать либо в изотропном приближении, тогда Тетруиу является числом, либо в анизотропном - тогда температурный фактор становится тензором 3 х 3. В первом случае атомы аппроксимируют сферами, а во втором-эллипсоидами, размеры которых определяются амплитудами колебаний.

Структурный фактор F^i описывает свойства отражения hkl и может быть представлен в виде

Fhkl. расч = I Гhkl. расч I е'Яш > (3-4) где | Fhki. расч I ~ величина, которую можно сравнивать со значением | F^, на6л | определяемым непосредственно по измеренным (наблюдаемым) интенсивностям

Ihkl-

Фактор расходимости. Чтобы улучшить молекулярную модель, рассчитанные по ней с помощью уравнения (3.3) структурные амплитуды | F^ расч I подгоняют под наблюдаемые структурные амплитуды |^Шка6п|, добиваясь минимального среднеквадратичного расхождения между ними, т.е. уточняют атомные координаты и температурные факторы методом наименьших квадратов. В литературе принято оценивать степень совпадения расчета с экспериментом фактором расходимости R:

1^набл1-1^|

расч

/X|F„a6J. (3.5)

hki

Мс!

Суммирование проводят по всем рефлексам.

Структурный фактор F(R, X,) для спиральных молекул. В рентгеноструктурном анализе волокон пользуются не декартовой системой координат, а цилиндрическими координатами атомов г, ф, z (см. рис. 2.15), поэтому в формулах появляется функция Бесселя [95-100]. Формула для структурного фактора, усредненного по угловой координате, имеет вид

F(R, 0=1^7„(2иКг;)^^-^>, (3.6) » J

где R, (^-радиальная и аксиальная координаты в обратном пространстве, ij, фу, Zj - координаты /-го атома в реальном пространстве, a fj-его фактор рассеяния, в который введена поправка на гидратационную воду [101]. J„- функция Бесселя и-ro порядка. Величина п связана с номером / слоевой линии, периодом спирали с, шагом Р и расстоянием h между остатками вдоль оси спирали соотношением

? = Ifc = п/Р + m/h, (3.7) где т- целое число, положительное или отрицательное.

Методы

45

. На рис. 3.2 приведена типичная рентгенограмма. Ее симметрия и систематические погасания рефлексов (см. подпись к рис. 3.2) дают информацию о пространственной группе кристалла, а расстояния между рефлексами определяют размеры элементарной ячейки. Каждый рефлекс характеризуют индексами Миллера hkl, отвечающими тем плоскостям, от которых происходит данное отражение.

Рис. 3.2. Рентгенограмма кристалла тринуклеозиддифосфата аденилил-(3',5')-аденилил-(3',5')-аденозина (АрАрА). На прецессионной рентгенограмме прямоугольником выделена элементарная ячейка обратной решетки. Угол рассеяния в определяется отношением расстояния на пленке к расстоянию от кристалла до пленки. С помощью уравнения (3.1) были рассчитаны размеры элементарной ячейки в реальном пространстве: а = 14,155 А, с — 44,00 А. Вдоль оси а присутствует каждый второй рефлекс, а вдоль оси с-каждый четвертый; систематическое отсутствие остальных рефлексов предполагает наличие винтовых осей 2-го и 4-го порядков. Этот факт и некоторые другие особенности дифракционной картины позволяют сделать вывод, что кристалл принадлежит тетрагональной пространственной группе P4j2j2 (или энантиоморфной ей группе Р432!2). Так как в данной пространственной группе все углы элементарной ячейки равны 90°, рентгенограмма обладает зеркальной симметрией относительно осей а и с. Дифракционные пятна имеют разную интенсивность и содержат информацию о распределении атомов в элементарной ячейке. Данная рентгенограмма представляет собой лишь одну из плоскостей обратной решетки. Всего было получено 3260 рефлексов, образующих в совокупности сферу, что соответствует разрешению 0,95 А [160]. Разные уровни разрешения (в А) на дифракционной картине Указаны окружностями. Прецессионная рентгенограмма была получена д-ром П. Мейнором; излучение СиК^, расстояние кристалл-пленка 60 мм.

46

Глава 3

Согласно уравнению (3.1), расстояние между плоскостями йш обратно пропорционально синусу угла падения вщ, поэтому чем больше расстояния между рефлексами, тем меньше размеры элементарной ячейки, и наоборот. Рентгенограмма представляет собой увеличенное изображение так называемой обратной решетки [44-47].

Информация о «содержимом» элементарной ячейки, т. е. о координатах атомов в асимметричной части, заключена в интенсивности рефлексов. Каждый дифрагированный кристаллом луч hkl характеризуется амплитудой |/ш1> которая пропорциональная корню квадратному из интенсивности Ihkh и фазовым углом (рис. 3.3). Если интенсивность отражений можно непосредственно измерить либо путем денситометриче-ского сканирования рентгенограмм, либо с помощью сцинтилляционно-го счетчика, вмонтированного в автоматический четырехкружный дифрактометр [48], то получить информацию о фазовых углах отражений можно только расчетным путем. В этом и состоит «фазовая проблема», которая доставляет кристаллографам массу неприятностей.

Рис. 3.3. «Фазовая проблема». Кристалл облучают монохроматическим рентгеновским пучком, который после прохождения через кристалл дифрагирует на множество лучей (h, к, I) с разными фазовыми углами щк1 и интенсивностями 1^1- Последние можно измерить по степени почернения пленки, но для расчета электронной плотности с помощью уравнения (3.2) необходимо иметь оба типа данных.

Методы

47

Фазовый угол определяют либо «прямыми методами», извлекая соответствующую информацию из распределения интенсивностей, либо методом «тяжелых атомов», связанным с анализом функции Паттерсо-на [44-47]. Если известны амплитуда | Fn/y | и соответствующие фазовые углы, то с помощью преобразования Фурье можно рассчитать распределение электронной плотности в элементарной ячейке.

Уравнение (3.2) представляет собой преобразование Фурье, которое связывает электронную плотность pXYZ в точке X, Y, Z с измеренными амплитудами | F^i \ и с соответствующими фазовыми углами аш (дополнение 3.1). На практике элементарную ячейку представляют в виде решетки (растрируют), с помощью ЭВМ рассчитывают электронную плотность в узлах X, Y, Z и вычерчивают соответствующие контурные линии (рис. 3.4).

Зная карту электронной плотности, можно определить положения всех атомов в структуре либо (поскольку фазы вначале часто бывают известны лишь приближенно) только части атомов. В последнем случае ^установленную часть структуры используют для уточнения фаз a^i, по-[рле чего расчет повторяют вплоть до получения полного решения. Полученные координаты атомов xj, yj, zj обычно уточняют полноматричным методом наименьших квадратов, в котором минимизируется квадрат разности между наблюдаемыми и рассчитанными структурными амплитудами | ^набл I

и j jFpacH I* Последние определяют по координатам атомов молекулярной модели в соответствии с уравнениями (3.3) и (3.4) (см. дополнение 3.1).

В конце процедуры уточнения рассчитывают «разностную электронную плотность» с коэффициентами | Рнабл — ^расч 1ш> которые подставляют в уравнение (3.2) вместо | F^i |. Это делают для того, чтобы локализовать те атомы, которые в модели были пропущены, т. е. не были учтены при расчете FpaC4. Обычно такими атомами являются атомы водорода или других элементов, которые статистически распределены по нескольким местам с неполной заселенностью (рис. ЗА, Б). Атомы водорода, обладающие одним электроном, рассеивают рентгеновские лучи существенно слабее, чем атомы второго и последующих рядов периодической таблицы, поэтому их координаты удается определить с точностью, ца порядок меньшей. Точные координаты атомов водорода определяют методом нейтронной дифракции. Нейтроны рассеиваются атомным ядром, а не электронами, и весьма интенсивно взаимодействуют с водо-одными атомами. 'Формула (3.5) в дополнении 3.1 дает оценку степени совпадения структурных амплитуд, рассчитанных по молекулярным моделям [уравнения (3.3) и (3.4)], с наблюдаемыми (измеренными) величинами. Для хорошо уточненных структур значения /^-факторов лежат в интервале 0,03-0,07. Обычно на неводородный атом асимметричной части ячейки приходится 100 рефлексов, а поскольку каждому атому соответствует 10 параметров, то отношение числа рефлексов к числу параметров равно 10:1. Параметрами атомов являются: три координаты х, у, z, коэффи-

Рис. 34. Л. Распределение электронной плотности pxyz в плоскости гетероциклического основания 5-этил-6-метилурацила; разрешение 0,8 А [161]. Изолинии проведены с интервалом \е А-3 начиная с уровня \е А~3 (пунктир). Четко видны атомы второго ряда периодической таблицы; атом водорода идентифицируется по выступам на пунктирной линии при атомах N. На карту электронной плотности наложено схематическое изображение молекулы (цветные линии). Б. Разностный синтез электронной плотности, рассчитанный с коэффициентами | FHa6„ - Fрасч |, где |^Набл|-ЭТ0 измеренные структурные амплитуды, а I -Ррасч I-структурные амплитуды, рассчитанные с учетом только атомов второго ряда [161]. Атомы водорода здесь проявляются как плотные сгустки изолиний; на карту наложено схематическое изображение молекулы и указана нумерация атомов. Водородные связи изображены в виде ряда цветных параллельных отрезков, атомы водорода этильной и метальной групп располагаются над плоскостью молекулы и поэтому на рисунке не представлены.

Методы

49

Рис. 3.5. Рентгенограмма фенилаланиновой тРНК дрожжей (тРНКдр5жжи) [162]. Уровень разрешения 4 А выделен так же, как и на рис. 3.2. По расстояниям между пятнами были определены параметры элементарной ячейки, а = 33,2 А, Ь = 56,1 А, с = 161 А. Систематическое отсутствие каждого второго рефлекса по осям с и а, а. также симметрия расположения пятен на рентгенограмме указывают на орторомбическую пространственную группу Р21221. Обратите внимание, что с улучшением разрешения интенсивность пятен постепенно уменьшается до полного их исчезновения. Предельное разрешение составляет примерно 2,3 А.

¦циент заполнения, который в случае неполной упорядоченности показывает, насколько «заселено» положение XYZ (1,0 соответствует полному заселению), и шесть параметров температурного фактора, описывающих колебания атомов в кристаллической решетке. Колеблющийся атом в кристаллической решетке аппроксимируется эллипсоидом, который характеризуется длинами трех главных осей и тремя угловыми параметрами, задающими ориентацию этих осей в элементарной ячейке. Эллипсоид можно заменить сферой сравнимого объема. В этом случае температурный фактор может быть задан только одним параметром и отношение числа рефлексов к числу параметров увеличивается до 20 :1 [уравнение (3.3)J Число измеряемых интенсивностей зависит от разрешения, т.е. от интервала 20, вне которого дифракционные пятна отсутствуют (рис. 3.5). Разрешение в свою очередь зависит от качества кристалла и от теплового движения атомов в решетке. Для малых мо-

4-509

50

Глава 3

Рис. 3.6. Упаковка молекул 5-этил-6-метилурацила [161] в кристаллической решетке. Молекулы построены с помощью объемных моделей атомов. Сферы, отвечающие атомам водоро