небольшим «раскручиванием» молекулы на угол 15-20°.

Рис. 14.3. Излом в В-ДНК. Показаны две взаимно перпендикулярные проекции [1012]. Определения угла а и расстояний d и D даны в тексте. Псевдоось 2-го порядка (вертикальная на верхнем и горизонтальная на нижнем рисунках) связывает два спиральных участка молекулы, примыкающие к излому.

348

Глава 14

Если изломы в ДНК периодически повторяются, то молекула принимает некую характерную форму. Так, образование изломов через каждые 5 пар оснований приводит к формированию зигзагообразной структуры, а если изломы происходят через каждые п - 10 пар, то образуется левая сверхспиральная структура, точно такая же, как в хроматине. Как мы увидим в гл. 19, в свете современных данных более вероятным представляется плавное изгибание ДНК в хроматине. Тем не менее понятие излома используется при описании «дыхания» двойной спирали.

14.3. %- И В-ИЗЛОМЫ ДНК: «ДЫХАНИЕ» СО СКОРОСТЬЮ ЗВУКА

Поскольку гипотеза изломов казалась приемлемым решением проблемы упаковки ДНК в хроматине, ее обобщили на случай комплексов динуклеозидфосфатов с интеркаляторами, которые используются в качестве модельных систем для изучения взаимодействия ДНК с лекарственными препаратами (гл. 16). В таких модельных комплексах, которые большей частью принадлежат к риборяду, самокомплементарные молекулы образуют мини-спирали; пары оснований в спирали раздвигаются, образуя щель размером 3,4 А, в которую входит интеркалятор. Этот процесс обычно сопровождается некоторым раскручиванием мини-спирали и (по крайней мере для большинства соединений) изменением конформацни сахара от С3.-эндо к Ст-эндо. Хотя в случае олиго-и полидезоксмрибонуклеотидов ситуация может оказаться иной, тем не менее предполагается, что при указанном изменении конформацни сахара и раскручивании соседних пар на угол — 10° в этом месте молекулы В-ДНК образуется излом с а ~40° [1012-1014]. Считается, что в хроматине такие изломы должны встречаться через каждые 10 пар оснований («и-изломы В-ДНК»). Изломы каждой второй пары приводят к менее определенной структуре-«В-ДНК с Р-изломами». Сегменты с такой структурой могут образовываться в ДНК непосредственно перед тепловой денатурацией или кратковременно возникать в АТ-богатых участках, облегчая тем самым взаимодействие ДНК с белками и лекарственными препаратами, которое включает интеркаляцию плоских боковых цепей ароматических аминокислот или других молекул.

Предполагается, что участки «В-ДНК с р-изломами» возникают в результате броуновских столкновений с молекулами растворителя. В большинстве случаев такие столкновения будут приводить к беспорядочным колебаниям в структуре ДНК, однако, если молекула растворителя случайно столкнется с ДНК в нужный момент времени, может возникнуть гармоническая волна, которая приведет к нормальным колебаниям («дыханию») и будет распространяться вдоль спирали со скоростью звука (акустическая волна). Это движение связывают со структурным переходом В-ДНК в «В-ДНК с Р-изломами»-спираль, у которой каждый второй сахарный остаток зафиксирован в С3.-эн<)о-конформации [1014].

Гипотезы и спекуляции

349

Мы не будем здесь касаться вопроса о том, насколько справедлива данная гипотеза. Отметим лишь, что двойная спираль действительно раскрывается на короткое время, поскольку при 0°С характерное время тритиевого обмена в ДНК составляет всего лишь ~ 5 мин, хотя температура плавления ДНК при этом превышает 80°. Было высказано предположение, что вдоль цепи ДНК мигрируют раскрытые участки длиной около 10 пар в виде возбуждаемых солитонами одиночных волн. Напоминают ли такие участки по своей структуре «ДНК с р-изломами» (или с изломами другого типа), пока неизвестно [1014а]. Однако следует уяснить, что ДНК, конечно же, не является абсолютно жестким стержнем; скорее следует рассматривать ее как молекулу с ограниченной макроскопической гибкостью, в которой происходят микроскопические локальные движения.

14.4. ИЗГИБЫ ДНК В МЕСТЕ СОЕДИНЕНИЯ СПИРАЛЕЙ А- И В-ТИПА

Если предположить, что для двойной спирали ДНК, как и для тРНК (гл. 15), характерна тенденция к насыщению стэкинга, становится интересной другая модель: для того чтобы молекула ДНК резко изогнулась, в нее вводится не излом (разрушение стэкинга), а лишь изменение конформации сахара [381, 1015].

Смешанная конформация сахара, стэкинг оснований и изгиб на 26° в месте (А-В)-контакта. При попытке объединить спирали В- (10-го по-'рядка) и А-ДНК (11-го порядка) в единую непрерывную спираль было обнаружено, что «стык» легко осуществляется, если в месте контакта два сахарных остатка пары имеют разную конформацию. Контакт выглядит наиболее приемлемым, когда при переходе от А- к В-ДНК сахар в цепи с полярностью 5' -»3' находится в С2--экдо-конформации, а сахар 'комплементарного нуклеотида-в С3-эндо-конформации. Несмотря на I такое конформационное изменение, стэкинг в месте перехода полностью сохраняется и все торсионные углы имеют обычные значения; тем не менее спираль при этом изгибается на угол 26° (рис. 14.4) и, поскольку В -»А-переход приводит к повороту пары на — 3,3°, немного раскручивается.

Описанные предположения подтверждаются некоторыми экспериментальными данными. На полное сохранение стэкинга в месте (А-В)-кон-|гакта указывают спектры КД и ЯМР гибридного дуплекса [poly(dG)(rC)11—(dC)16], в котором «ДНК-участки» находятся в В-форме, а соседние (гС)п-сегменты-в А-форме [1015, 1016]. Раскручивание, обусловленное (В -»А)-переходом, действительно наблюдается при связывании ДНК с РНК-полимеразой в форме холофермента [1017]. Длина промоторного участка, оцененная по величине угла раскручивания 140°, составляет 40 нуклеотидов, что находится в очень хорошем соответствии с данными по анализу различных промоторов [1018].

Легко видеть1, что непрерывный ряд таких изгибов, т.е. последова-

350

Глава 14

Рис. 14.4. (А-В)-контакт в структуре двойной спирали [1015]. У пары оснований, расположенной в точке контакта, один сахарный остаток находится в С2.-эндо-конформации, а другой-в С3 -эиЭо-конформации, но все торсионные углы имеют обычные значения и в отличие от ДНК с изломами (рис. 14.3) полностью сохраняется стэкинг оснований. Ось спирали, показанная цветной линией, изгибается на 26°.

Гипотезы и спекуляции

351

тельность (А-В)-контактов, приведет к тому, что спираль ДНК совершит полный оборот без каких бы то ни было изломов в цепи и в целом останется более или менее гладкой. Кроме того, поскольку А-и В-ДНК «энергетически близки», вполне возможно, что динамическое поведение ДНК обусловлено миграцией А-ДНК-кластеров вдоль спирали В-типа, а не кластеров Р-изломов, наличие которых привело бы к более существенным структурным изменениям.

Следует заметить, что реально существующие в ДНК некоторых эукариот протяженные участки poly (dA) • poly (dT) являются терминаторами транскрипции [1016а]. Это экспериментальное наблюдение можно объяснить структурными особенностями таких участков. Известно, что полинуклеотид poly (dA) • poly (dT) [но не poly(dA—dT)] является кон-формационно жестким и может находиться только в В'-форме. Следовательно, В-»А-переход в таких участках не происходит, что, возможно, и препятствует их связыванию с РНК-полимеразой [1016Ь].

14.5. «ВЕРТИКАЛЬНАЯ» ДВОЙНАЯ СПИРАЛЬ

В СЛУЧАЕ ПОЛИНУКЛЕОТИДОВ С высокой-онгаы-КОНФОРМАЦИЕЙ

Когда основания в полинуклеотиде находятся в высокой-анти{ — ск)-конформации (например, из-за образования связи между атомом С6 пиримидина или С8 пурина и атомом С2- сахара), полинуклеотид может образовывать одноцепочечные спирали двух типов: левую, с основаниями, перпендикулярными оси спирали, и правую, с почти параллельными оси основаниями.

На основе последней структуры можно построить «вертикальную» двойную спираль с уотсон-криковскими парами, параметры которой значительно отличаются от параметров двойных спиралей ДНК и РНК [1022, 1023] (рис. 14.5). Пары оснований в такой спирали располагаются почти параллельно оси, а сахарофосфатный остов с основаниями в высокой-анти (— ск)-конформации обвивает ось на расстоянии от 8 до 18 А (= радиусу спирали) в зависимости от выбранной модели. Значения всех торсионных углов в целом близки к таковым для двойных спиралей ДНК и РНК, причем можно построить модели как с конформацией сахара С3.-эндо, так и с конформацией С2.-эндо. Гипотетическая «вертикальная» двойная спираль целиком основана на компьютерных модельных построениях, однако ее адекватность подтверждается результатами спектроскопических исследований, которые показывают, что гомополинуклеотиды с основаниями, зафиксированными в высокой-анти ( — ск)-конформации, способны образовывать одно-, двух-и трехцепочечные спиральные структуры, напоминая тем самым систему poly (A)-poly (U) [1024-1026].

Приведенные примеры показывают, что построить разумную с точки зрения стереохимии модель структуры относительно просто; довольно трудно доказать, что такая модель неверна, но еще труднее доказать, что она справедлива.

Глава 14

Рис 14 5 Две проекции (перпендикулярная оси спирали и вдоль оси) модели «вертикальной» двойной спирали, построенной для дуплекса

poly (A)- poly (U) [1022]. Цепь poly(U) изображена более жирными линиями, чем цепь poly (А); пунктиром показаны водородные связи. Обратите внимание на почти вертикальную ориентацию оснований, находящихся в

высокой-анти ( — ск)-конформации, и большой радиус спирали.

Гипотезы и спекуляции

353

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ

В этой главе описаны некоторые гипотетические структуры ДНК и РНК, основанные главным образом на теоретических расчетах. Чтобы избежать «распутывания» цепей при репликации двухцепочечной ДНК, была предложена модель «бок о бок», в которой правая спираль сменяется левой и, наоборот, через каждые полвитка, или через каждые пять нуклеотидов. Способность ДНК закручиваться вокруг нуклеосом-ного кора объяснялась изломами в двойной спирали, а не ее плавным изгибанием, причем изломы образовывались путем изменения конформации сахара и (или) торсионного угла у. Изломы двойной спирали использовались для объяснения поведения ДНК при температурах, близких к Тт, а также в процессе интеркаляции в ДНК лекарственных препаратов. Предполагается также, что изгибы (или изломы) возникают на переходных участках, когда в пределах одной спирали встречаются структуры А- и В-типов. Для полинуклеотидов с основаниями в высокой-анти( — ск)-конформации была предложена модель «вертикальной» двойной спирали. Закручивающаяся спираль располагается довольно далеко от оси, и внутри остается цилиндрическая полость большого радиуса.

ГЛАВА 15

т РНК-сокровищница стереохимической информации

тРНК-одна из наиболее подробно изученных биологических макромолекул. Связь между ее структурой и функциями рассмотрена во многих книгах и статьях [164, 1027-1038]. Описаны ее спектроскопические свойства, причем особое внимание уделено динамическим аспектам [1027], хорошо изучена термодинамика ее конформационных переходов [449, 554, 1027, 1039, 1040]. Обсуждение всех структурно-функциональных аспектов тРНК увело бы нас слишком далеко, поэтому мы отсылаем читателя к указанным работам и в данной главе сконцентрируем свое внимание непосредственно на структурных проблемах: на первичной, вторичной и третичной структуре тРНК, на роли стэкинга и спаривания оснований в стабилизации спиралей и петель, на конформацни нуклеотидов и взаимодействии тРНК с ионами металлов.

15.1. ПЕРВИЧНАЯ И ВТОРИЧНАЯ СТРУКТУРА тРНК. «КЛЕВЕРНЫЙ ЛИСТ»

Общие выводы, основанные на анализе нуклеотиднои последовательности 200 молекул тРНК. Типичная молекула тРНК-это полинуклеотидная цепь длиной от 75 до 90 нуклеотидов. В ней встречаются не только четыре стандартных типа нуклеотидов, но и приблизительно 10% «редких», или минорных; некоторые из них уже упоминались в разд. 7.4. Проведен анализ первичной структуры примерно 200 известных молекул тРНК [1037, 1041, 1042]. Все они могут быть уложены таким образом, что получается вторичная структура, напоминающая по форме клеверный лист (рис. 15.1).

Каждый из четырех стеблей «клеверного листа» состоит из 4-7 уот-сон-криковских пар, образующих двойные спирали. Стебли называются акцепторным, антикодоновым, D- и Т-стеблями. Акцепторный стебель содержит 3'- и 5'-концы полинуклеотидной цепи, причем к концевой з'-гидроксильной группе (С—С—Aq3.H) присоединяется специфическая аминокислота, отвечающая последовательности антикодонового триплета в антикодоновой петле (генетический код см. в разд. 6.9). D- и Т-стебли названы так потому, что соответствующие петли содержат диги-

тРНК-сокровищница стереохимической информации 355

Рис. 15.1. Вторичная и третичная структура дрожжевой тРНК , «клеверный лист» {слева) и Г-форма (справа) [1031]. Инвариантные в тРНК класса I основания помечены кружками, полуинвариантные заключены в круглые скобки. Точками отмечены уотсон-криковские пары, маленьким кружочком-«качающаяся» пара (G4-U69). Число нуклеотидов в вариабельной петле V и в областях а и Р зависит от вида тРНК. Тонкими линиями соединены пары оснований, которые образуют «третичные» водородные связи. Обратите внимание, что большинство инвариантных и полуинвариантных остатков расположено в середине буквы Г и в шарнирной области и образует третичные водородные связи, которые наряду со стэкингом оснований (рис. 15.3) стабилизируют пространственную структуру тРНК. Черным цветом показано, какие части «клеверного листа», объединяясь, образуют «ножку» буквы Г.

дроуридин (D) и риботимидин (Т). Число нуклеотидов в стеблях и петлях, вообще говоря, постоянно, за исключением вариабельных петель, которые у большинства тРНК состоят из 4-5 нуклеотидов (класс I), но в некоторых случаях могут включать от 13 до 21 нуклеотида (класс II). Число нуклеотидов в а- и Р-областях D-петли варьирует от 1 до 3 у различных видов тРНК.

Инвариантные и полуинвариантные нуклеотиды. Если последовательности всех тРНК расположить одну под другой, то окажется, что в некоторых позициях всегда находятся одни и те же нуклеотиды; их называют инвариантными. В других местах оказываются только пуриновые нуклеотиды (R), только пиримидиновые (Y) или только гипермодифици-рованные пуриновые (Н); все это так называемые полуинвариантные нуклеотиды. Из рис. 15.1 видно, что большинство инвариантных и полуинвариантных нуклеотидов сконцентрировано в районе петель. Структурная интерпретация этого явления основана на особенностях пространственной укладки цепи тРНК.

23*

356

Глава 15

15.2. СВЕРТЫВАНИЕ «КЛЕВЕРНОГО ЛИСТА» В ТРЕТИЧНУЮ СТРУКТУРУ. Г-ФОРМА

Как расположены в пространстве четыре ветви «клеверного листа»? Третичная структура, установленная по данным рентгеноструктурного анализа. Еще до того, как в 1973 г. было завершено первое рентгеноструктур-ное исследование кристаллов тРНК [1043], предпринимались попытки построить модели тРНК на основании имеющихся физических и химических данных и предсказать, как происходит свертывание молекулы тРНК в пространстве [235, 1044]. Особенно близка к общепринятой в настоящее время структуре одна из моделей, предложенная Левиттом. Она верно предсказывает даже большинство пространственных контактов [