координатам атомов, приведенным в работе [358]. Атомы Н не указаны.

ком далеко друг от друга, чтобы можно было говорить о наличии внутримолекулярного стэкинга, однако имеется явный межмолекулярный стэкинг с участием оснований соседних молекул.

Координационное связывание Na+ с атомами 02 тиминов. Фосфаты и основания молекулы d(pTpT) сильно гидратированы, и атомы 02 обоих тиминов образуют координационные связи с ионами Na +, тогда как атомы 04 образуют только водородные связи с молекулами воды. С аналогичной ситуацией мы уже сталкивались при рассмотрении структуры димера ApU; это дает основания полагать, что, по-видимому, взаимодействие (кето)02 •••1Ма+ является специфическим.

Одноцепочечная спираль с вывернутыми наружу основаниями. Поскольку конформацни двух нуклеотидов в d(pTpT) сходны, можно построить соответствующую полинуклеотидную структуру, исходя из молекулярной структуры динуклеотида. В результате получается правая спираль с вынесенными на периферию и наклоненными на угол 48° основаниями (рис. 13.10). Это нецелочисленная спираль-на шаг 25,2 А приходится 7,2 остатка, т.е. угол спирального вращения равен 50°, а расстояние между остатками вдоль оси спирали составляет 3,5 А.

Рис. 13.10. Модель одноцепочечной спирали poly(dT), построенная на основании кристаллической структуры d (рТрТ) [358]. Это правая спираль с шагом 25,2 А и числом нуклеотидов на виток 7,2; основания вывернуты «наружу», и, следовательно, стэкинг отсутствует.

Структура синтетических гомополимеров

334

Г шва 13

13.5. АНТИПАРАЛЛЕЛЬНЫЕ ДВОЙНЫЕ СПИРАЛИ А-ТИПА У ПОЛИНУКЛЕОТИДОВ POLY(U), POLY(s2U) И POLY(X)

Образование структур типа шпилек. В противоположность полину-клеотиду poly(dT) его рибоаналог poly(U) при низкой температуре (~ 5°) обладает вторичной структурой, которую можно выявить по ги-похромному эффекту в УФ-области, а также при помощи ЯМР, кругового дихроизма, светорассеяния, инфракрасной спектроскопии и по изменению вязкости и кинетических параметров методом температурного скачка [237, 459, 460, 971, 972]. Структура состоит из шпилек, которые образуются, когда цепь складывается сама на себя и формирует антипараллельные двойные спирали с несимметричными парами, показанными на рис. 13.1 [237, 460]. Относительно короткие спиральные фрагменты poly(U) плавятся кооперативно и стабилизируются высокой концентрацией противоионов и полиаминов [972, 973].

Так как полиамины могут повышать температуру плавления poly (U) до 28°, удается приготовить волокна poly(U), используя в качестве про-тивоиона спермин, и применить для их исследования рентгеноструктурный анализ [974]. Получается довольно размытая (диффузная) рентгенограмма, по которой удается определить лишь шаг спирали (24 А) и оценить число нуклеотидов на виток (9-11). Тем не менее можно предположить, что спираль poly(U) похожа по структуре на свой тиокетоа-налог poly(s2U) [461].

2-тиокетозамещенне в нуклеиновых кислотах повышает температуру плавления. Температура плавления нуклеиновых кислот повышается, если в пиримидиновые основания ввести 2-тиокетогруппу. Особенно сильный эффект наблюдается в случае poly (s2U)- при одной и той же ионной силе температура плавления poly(U) равна 5,8°, a poly (s2U)- 68,5° [975]. 4-тиокетозамещение сопровождается лишь слабым стабилизирующим, а иногда даже дестабилизирующим эффектом. Причины этого явления будут обсуждаться ниже.

Для poly(s2U) в отличие от poly(U) получается рентгенограмма достаточно хорошего качества, похожая по своим параметрам на рентгенограмму А-ДНК [461]. Судя по этой рентгенограмме, в случае poly(s2U) образуется антипараллельная двойная спираль с числом пар на виток, равным 11, высотой витка 28,8 А, отрицательным углом наклона пар относительно оси спирали и типичной для структур А-семей-ства конформацией сахара C3-3Wi3o (рис. 13.11). Конформационные параметры спирали указаны в табл. 9.3.

Двойная спираль без осей 2-го порядка. Из-за неэквивалентности двух гликозидных связей пары s2U—s2U (образованной водородными связями N3H--S2 и N3H--OJ исчезает ось симметрии 2-го порядка, связывающая полинуклеотидные цепи друг с другом. Следовательно, теперь две цепи не обязательно идентичны, поэтому их называют по-разному-а- и Р-цепи [461]. В дальнейшем при уточнении модели по методу наименьших квадратов было показано, что различие между цепями невелико и касается главным образом величины угла вращения вокруг

Структура синтетических гомополимеров

Рис. 13.11. Спираль poly(s2U)-poly (s2U) с парами s2U—s2U, которые по своей геометрии сходны с парами U—U, показанными на рис. 13.1. Двойная спираль poly(s2U) похожа на спираль А-ДНК и А-РНК. Структурный мотив повторяется через каждые 28,8 А и состоит из 11 нуклеотидов. Атомы серы изображены большими кружками. Структура построена по координатам, приведенным в работе [461]. Описание деталей изображения и масштаб даны в подписи к рис. 10.1.

336

Глава 13

Рис. 13.12. Схема перекрывания оснований в спирали poly (s2U)- poly (s2U), иллюстрирующая наличие взаимодействия S2---N„ которым обусловлена необычная стабильность двухцепочечной спирали poly(s2U) (Гт = 68,5°).

\

гликозиднои связи [976]. Можно было бы предложить и другую модель, согласно которой одно из оснований s2U представлено в виде енольной таутомерной формы с образованием симметричной пары. Однако в свете соображений, изложенных в работе [461], последнее представляется маловероятным.

Почему poly (s2U) гораздо стабильнее, чем poly (U)? Из схемы стэкинга оснований в poly (s2U), приведенной на рис. 13.12, видно, что атом S2 располагается непосредственно над атомом Nx соседнего нуклеотида. Именно такое взаимодействие, на основе которого формируется повторяющийся структурный мотив, многократно наблюдалось в кристаллических структурах нуклеозидов и оснований, содержащих тиокето-группы [453]. Таким образом, мы можем заключить, что повышенная стабильность всех полимеров, содержащих 2-тиокетопиримидины, обусловлена именно этим типом взаимодействия, которому способствует сильная поляризуемость и гидрофобный характер атома серы [975]. В полимерах с 4-тиокетогруппами взаимодействие типа S---N невозможно, поэтому никакой стабилизации не наблюдается.

Стабильность спиралей poly (dT), poly (rT), poly (dU) и poly (U) различается. Ключевая роль атома Ог. Почему вторичная структура poly(dT) менее стабильна, чем poly(U)? Данные ЯМР показывают, что в случае oligo (dT) сахарные остатки предпочитают находиться в С2.-эмдо-конформации, а в случае oligo(Ц)-в С3-эмдо [146, 147, 237, 970]. Аналогичное различие обнаружено также у аденозиновых аналогов oligo (dA) и oligo (А) [331, 958]. Различие в конформацни сахарных остатков может быть обусловлено различиями либо в электроотрицательности (разд. 4.3), либо в геометрии стэкинга, который неодинаков у С2.-эмдо- (В-семейство) и С3.-эмдо-полинуклеотидов (А-семейство).

Другим фактором, увеличивающим относительную стабильность двойной спирали poly(U), могло бы быть образование водородной связи (непосредственно или через водный мостик) между группой 02.Н одного остатка рибозы и атомом 04. соседнего [237]. Имеющиеся в настоящее время данные не позволяют сказать, какой эффект сильнее, однако совершенно ясно, что 02.Н-группа играет важную роль в стабилизации спирали. Это особенно очевидно при сопоставлении полинуклеотида poly (dU), у которого вторичная структура отсутствует, с poly (U) или

Структура синтетических гомополимеров

337

poly(dT) с poly(rT), структура которого, судя по температуре плавления, даже более стабильна, чем структура poly(U) [402].

Пуриновая двойная спираль, образуемая полнксантиловой кислотой. В пуриновом основании ксантине присутствуют такие же функциональные группы, что и в урациле. Следовательно, при спаривании оснований возникает такая же ситуация, что и в случае урацила и 2-тиоура-цила (s2U), т.е. либо образуются несимметричные пары (XVI на рис. 6.1), либо один из партнеров находится в енольной таутомерной форме, и тогда пары симметричны. Какими бы ни были пары, рентгенограммы волокон показывают, что в зависимости от рН среды можно наблюдать две структурно родственные формы двойной спирали. Та из них, которая образуется при рН 5,7, представляет собой спираль 10-го порядка. Расстояние между нуклеотидами вдоль оси спирали h равно 3,01 А, и рентгенограмма напоминает рентгенограмму А-РНК. Для другой спирали, которая образуется при рН 8,0, h равно 2,52 А, на виток приходится 11 пар оснований и рентгенограмма больше похожа на рентгенограмму о А-ДНК. В обоих случаях межгликозидное расстояние Сх—Сг на 2 А больше, чем в уотсон-криковских парах, потому что пара состоит из двух пуринов [854].

13.6. «липкий» гуанозин. структура гелей из гуанозина и гуаниловой кислоты. четырехцепочечные спирали p0ly(G) И p0ly(I)

Чтобы образовался гель, нужны вакансии для водородных связей и высокая концентрация соли. В отличие от всех остальных компонентов нуклеиновых кислот гуанозин, гуаниловая кислота и их производные (но не свободный гуанин) в водном растворе образуют гели. Анализ более 60 гуанозиновых производных показал, что для образования геля (1) группы NtH, N2H, N, и 06 в молекуле должны быть свободны, т.е. не должны участвовать в образовании водородных связей; (2) должны присутствовать гидроксильная группа 05.Н или ее заместители: фосфат, сульфат или хлор (но не другой заместитель); (3) важно, чтобы имел место некоторый избыток (~ 0,1 М) основной соли [978].

Гель из нуклеотидов образуется только в том случае, если мы имеем Дело с моноанионами, которые существуют при значениях рН выше первого рК фосфатной группы. При нейтральных рН гуанин-5'-фосфат еще формирует упорядоченные структуры, но гель уже не образуется [979].

Для образования геля в раствор необходимо добавить соль. Если соль присутствует не в избытке, то мононатриевая соль гуанозин-5'-фос-фата и сам гуанозин образуют не гель, а кристаллы [980, 981].

Стопки из тетрамерных плоских агрегатов в геле нз гуанозиновых производных и гуанозин-З'-фосфата. Представление о структуре гелей, оторые формируются из гуанозинсодержащих молекул, было получено на основании данных рентгеноструктуриого анализа [982, 983]. Во всех

22-509

338

Глава 13

случаях образуются показанные на рис. 13.1 плоские тетрамерные агрегаты, в которых мономеры «скреплены» друг с другом посредством водородных связей между остатками гуанина. Далее эти плоские агрегаты укладываются друг на друга, образуя стопки с выступающими к периферии сахарными остатками. Взаимодействие между соседними слоями в стопке, по-видимому, не ограничивается стэкингом. Из того факта, что гели формируются при замещении 05.Н-группы на фосфат, сульфат и ион хлора, следует, что все эти группы также вовлечены во взаимодействие, образуя, по-видимому, водородные связи с гуаниновыми остатками в соседнем слое [978, 984].

Ориентация отдельных тетрамерных слоев в стопке неодинакова -каждый следующий тетрамерный слой повернут относительно предыдущего на определенный угол (вокруг оси стопки), причем величина этого угла зависит от вида сахара. В гуанозиновых гелях два последовательных слоя повернуты друг относительно друга на угол 45°, в 8-бром-гуанозиновых-на угол 54° (вероятно, из-за смн-конформации основания). В дезоксигуанозине угол поворота равен — 54°, откуда можно заключить, что одним из факторов, определяющих структуру, является образование водородной связи с гидроксилом ОгН в гуанозине [978, 984].

Во всех перечисленных случаях слои в стопке «смотрят» в одну сторону (выстроены в шеренгу), поэтому на рентгенограммах присутствуют характерные рефлексы, отвечающие расстоянию ~ 3,4 А [984]. Но в гелях из 2,3'-0-диацетилгуанозина и из гуанозин-З'-фосфата слои обращены один к другому («лицом к лицу»), что приводит к появлению характерных рефлексов, отвечающих удвоенному межплоскостному расстоянию 3,4-2 А, т.е. ~ 6,8 А.

Гуаиозин-5'-фосфат образует спиральные агрегаты. В гелях гуанозин-З'-фосфата тетрамерный ассоциат оснований не плоский, он разрезан наподобие пружинной шайбы. В результате из тетрамеров формируется «непрерывная» спираль, по-видимому, левая, на каждые ее 4 витка приходится 15 нуклеотидов [982, 983]. Чтобы изменить структуру таким образом (от стопки из плоских агрегатов до спирали), достаточно незначительно деформировать водородные связи-сама система усилит любое изменение в 4 раза. Структура спирали, по-видимому, стабилизируется с помощью водородной связи между группой N2H гуанина и 5'-фосфатом нуклеотида, расположенного в соседнем слое (в гуанозин-З'-фосфате такое взаимодействие невозможно). Если хранить натриевую соль гуанозин-5'-фосфата в нейтральном растворе, содержащем 1,3 М NaCl, то образуются кристаллические волокна, которые после ориентации под рентгеновским пучком дадут рентгенограмму, напоминающую рентгенограмму правой четырехцепочечной спирали poly(G), которую мы будем обсуждать ниже [985].

Результаты спектроскопических исследований согласуются с рентгеновскими данными. Структурные модели гелей, образуемых гуанози-новыми производными и гуанозин-3'- и гуанозин-5'-фосфатами, в целом

Структура синтетических гомополимеров

339

согласуются с результатами спектроскопических исследований. Данные по изменению поглощения в УФ-области и по изменению давления паров над раствором показывают, что формирование геля-это в высшей степени кооперативный процесс, механизм которого описывается схемой Мономере Тетрамера Октамер*± Полимер [986]. Судя по поведению пиков резонансного поглощения 'Н, 23Na и 31Р в спектрах ЯМР нейтральных растворов натриевой соли гуанозин-5'-фосфата, при концентрации нуклеотида ниже 0,2 М наблюдается нормальный стэкинг оснований. При концентрации выше 0,3 М нуклеотиды образуют скрепленные водородными связями ассоциаты, преимущественно тетра-меры, октамеры и гексадекамеры. Энтальпия самосборки ассоциатов равна АН = — 17 + 2 ккал • моль"1, энтропия AS = — 51 ±6 кал • моль"1 • • К"1 (в отличие от положительного изменения энтропии, которое наблюдалось бы в процессах с нормальным стэкингом) [987].

Почему для образования геля нз производных гуанознна нужен избыток соли? Исследования методом ЯМР убедительно показали, что катион является неотъемлемой частью гуаниновых тетрамерных ассоцита-тов (рис. 13.13) [987, 988]. Он располагается в центральной полости, окруженный четырьмя атомами кислорода Об кетогрупп, каждый из которых удален от центра на расстояние 2,28 А [985]. Это на 0,88 А больше вандерваальсова радиуса кислорода. Анализ значений ионных радиусов для Li+ (0,68 A), Na+ (0,97 А), К+ (1,33 A), Rb+ (1,47 А) и Cs + (1,67 А) [196] показывает, что ион Li+ слишком мал и не может заполнить всю центральную полость; размеры ионов Na + , К+ и Rb+ таковы, что эти ионы заполняют полость, располагаясь либо непосредственно в ее центре, либо несколько выше, между двумя соседними слоями, в окружении восьми атомов кислорода; наконец, ион Cs+ слишком велик и, по-видимому, не умешается в полости, а потому не может способствовать агрегации гуанозинов с образованием тетрамерных ассоциатов. Вообще говоря, прослеживается параллель между

тими специфическими комплексами