Биологический каталог




Принципы структурной организации нуклеиновых кислот

Автор В.Зенгер

овать для экспериментов с Z-ДНК in vivo.

12.5. ИМЕЕТ ЛИ Z-ДНК БИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ?

Существует ли Z-ДНК in vivo или это экспериментальный артефакт? Если Z-ДНК действительно существует, то какова ее роль в функционировании ДНК? Хотя этот вопрос возник совсем недавно и потому на него трудно дать полный ответ, все же полученные данные свидетельствуют о том, что Z-ДНК имеет биологический смысл

Переходу В —> Z способствует наличие последовательности (dm5C—dG). В ДНК эукариот последовательность (dm5C—dG) встречается довольно часто (главным образом из-за метилирования ДНК), что сопряжено с работой аппарата регуляции транскрипции генов [928]. Как видно из табл. 122, полинуклеотид poly(dG—dm5C)poly (dG—dm5C) при физиологических условиях образует Z-форму. Следовательно, вполне возможно, что наиболее длинные участки последова-

Левые комплементарные двойные спирали

317

тельности (dG—dm5C) в молекуле ДНК находятся в Z-форме. К какому же результату может привести появление Z-ДНК в геноме?

Включение в плазмиду участка, находящегося в Z-форме, меняет топологию этой молекулы. Плазмиды-замкнутые кольцевые молекулы двухцепочечных ДНК разрезали, встраивали в них участки с последовательностью poly (dG—dC) и вновь замыкали в кольцо [929, 929а]. Как мы увидим в гл. 19, кольцевые замкнутые ДНК могут образовывать сверхспирали (т.е. спирали из замкнутой двухцепочечной ДНК). При высокой плотности сверхвитков в (dG—dQn-блоках таких плазмид даже при физиологических условиях (200 мМ NaCl) происходит В -» -»Z-переход. Более того, в соответствии со сказанным выше, замена dC на dm5C во фрагментах (dG—dC) способствует переходу и, что самое удивительное, если уменьшать концентрацию NaCl, можно получить Z-форму даже при меньшей плотности сверхвитков. Как отмечается в работе [929], в данном случае В-»Z-переход является неполным: в месте перехода от В- к Z-форме имеется участок длиной в 11 пар оснований, который находится в состоянии, промежуточном между левой и правой спиральными формами.

Примечательно, что даже если длина фрагментов (dG—dC) составляет всего лишь 1,3% от полной длины плазмидной ДНК, параметры сверхспирализации плазмиды уже радикально изменяются. Как показано в гл. 19, чередование В- и Z-форм в плазмиде меняет райзинг и кручение, т.е. параметры, описывающие общую топологию кольцевой замкнутой ДНК. Таким образом, В -»Z-переход модифицирует общую структуру ДНК, а следовательно, может оказаться важным для регуляции экспрессии генов.

И последний вопрос, на который осталось ответить: существует ли Z-ДНК in vivo?

Z-ДНК обнаружена в полнтенных хромосомах. При инъекции кроликам модифицированных poly (dG—dC), которые при физиологических условиях находятся в Z-форме (разд. 12.4), удается вызвать образование у них антител к Z-ДНК. Такие антитела были выделены, в них ввели флуоресцентную метку, а затем инкубировали с политенными хромосомами Drosophila melanogaster [925]. Это особая форма хромосом, которая состоит из тысячи и более хроматид, уложенных бок о бок без какого-либо сдвига, что позволяет усилить любой сигнал, который с помощью обычных хромосом обнаружить невозможно. В результате эксперимента были зафиксированы яркие флуоресцирующие полосы, которые однозначно указывали на наличие Z-ДНК в междисковых областях политенных хромосом.

Этот эксперимент доказывает, что Z-ДНК в хромосомах действительно существует. Хотя описанные исследования проведены in vitro, тем не менее есть основания полагать, что in vivo в хромосомах также содержатся участки Z-ДНК. В этой связи интересен следующий факт. Полинуклеотид poly (dG—dm5C) при низкой концентрации соли, т.е. в условиях, когда он находится в В-форме, связывается с гистоновыми

318

Глава 12

октамерами и образует нуклеосомы [925а]. Однако при высокой концентрации соли, когда полинуклеотид имеет конформацию левоспи-ральной Z-ДНК, он хотя и связывается с гистонами, но характерных ну-клеосомных частиц уже не образует (гл. 19). Следовательно, нуклео-сомные частицы может образовывать только В-ДНК; переход в Z-форму разрушает структуру нуклеосомы, а значит, и структуру состоящего из нуклеосом хроматина.

Тем не менее биологическая роль Z-ДНК еще не вполне ясна. Возможно, она выполняет какую-то регуляторную функцию, тем более что B->Z-nepexofl обратим. Регуляция экспрессии может включать и сверх-спирализацию [925], и связывание с белками, специфичными к Z-ДНК, и связывание с определенными катионами типа спермидина (табл. 12.2), и метилирование d(C).

Левая спираль Z-ДНК транскрибируется н взаимодействует с лекарственными препаратами. Было показано, что MgCl2 и этанол действуют синергично и переводят poly (dG—dC) в Z-форму даже тогда, когда их концентрация очень мала (табл. 12.2) [924а]. Z-ДНК, которая при этом продуцируется, седиментирует быстрее, чем такая же Z-ДНК, образующаяся при высокой концентрации соли, поэтому ее назвали Z*^HK. г*-ДНК служит матрицей для РНК-полимеразы Е. coli, причем скорость транскрипции примерно вдвое меньше, чем в случае правой спирали poly (dG—dC). Неясно, однако, действительно ли РНК-полимераза транскрибирует Х*-ДНК или левая спираль в ходе транскрипции преобразуется в правую. г*-ДНК, кроме того, связывается с интеркали-рующими соединениями-этидием и актиномицином D, а также образует комплекс с неинтеркалирующим антибиотиком-митрамицином.

Итак, обнаружение Z-ДНК-это еще одна веха в истории структурных исследований ДНК. Изучение биологической роли Z-ДНК уже началось, и есть основания надеяться, что оно поможет понять механизм экспрессии генов, пока до конца не установленный.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ

Если полинуклеотид poly (dG—dC) поместить в водный раствор с высокой концентрацией MgCl2, NaCl или спирта, то образуется левая двойная спираль-Z-ДНК. У этой спирали сохраняется уотсон-криковское спаривание оснований, однако у гуанозина сахар находится теперь в С3.-эндо-конформации, основание-в сын-ориентации и угол у лежит в области an, тогда как для цитидина соответствующие параметры-это С2--эндо, анти и + ск. В зависимости от условий среды образуются Z-, Z,-, Zn- и Z'-ДНК, которые составляют Z-семейство. Z-форму стабилизируют спермин, двухвалентные катионы и введение определенных химических модификаций. Z-ДНК, по-видимому, имеет определенное биологическое значение. Она обнаружена в хромосомах дрозофилы и, вероятно, участвует в регуляции сверхспирализации ДНК (гл. 19).

ГЛАВА 13

Структура синтетических гомополимеров

Обратимся к рис. 6.1, из которого видно, что спаривание оснований путем образования водородных связей не ограничивается взаимодействиями между комплементарными партнерами. Однотипные основания тоже могут ассоциировать, и, хотя эти ассоциаты менее стабильны, чем комплементарные пары, тем не менее результаты рентгеновской дифракции на монокристаллах подтверждают, что во многих случаях подобные ассоциаты образуются [192].

Антнпараллельная н параллельная ориентация цепей в двойных спиралях гомополимеров. Если принять во внимание возможность спаривания однотипных оснований, то образование ассоциатов однотипных гомополимеров перестает вызывать удивление. Пары оснований в таких двухцепочечных структурах могут и не быть симметричными; так, например, в случае poly(s2U) - poly(s2U) ось 2-го порядка, расположенная в плоскости пары, связывает между собой гликоэидные связи Сг—N не точно, а лишь приблизительно (рис. 13.1), и полинуклеотидные цепи, как и в уотсон-криковских двойных спиралях, антипараллельны. В случае дуплексов с симметричными парами, например в двойной спирали poly(AH +) ¦ poly(AH + ), которая образуется в кислых растворах, наблюдается совершенно иная ситуация. Здесь ось 2-го порядка, связывающая гликоэидные связи, перпендикулярна плоскости пары и совпадает с осью спирали (рис. 13.1). В результате два сахарофосфатных остова переходят друг в друга при повороте вокруг оси спирали на 180° и ориентированы параллельно, а на периферии двойной спирали образуются два совершенно одинаковых желобка, т. е. на самом деле имеется только один тип желобка

Параллельные цепн в четырехцепочечных спиралях. С другим удивительным свойством гомополимеров мы сталкиваемся при рассмотрении полинуклеотидов poly(G) и poly(I) [2-дезаминированного аналога poly(G)], каждый из которых образует четырехцепочечную спираль. В этих спиралях поворотная ось 4-го порядка совпадает с осью спирали, в результате образуется жгут из четырех идентичных полинуклео-тидных цепей и опять имеется только один тип желобка.

Одноцепочечные спирали. Картина еще более усложняется тем что гомополимеры могут также существовать в виде одноцепочечных спи-

320

Глава 13

Симметрия отсутствует

Симметрия * 2-го порядка

Цепи параллельны

Рис. 13.1. Схемы спаривания оснований, обнаруженные у самоассоциатов гомо-полимеров. Образование несимметричных пар U—U и s2U—s2U приводит к антипараллельной (как у двойных спиралей А-РНК) ориентации полинуклеотидных цепей. У симметричной пары АН + —АН+ и у наполовину протонированной пары С—СН + ось симметрии 2-го порядка совпадает с осью спирали, поэтому имеет место параллельная ориентация цепей. Тетрамер G—G—G—G образуется в гелях гуанозина и гуаниловой кислоты, а также в спирали [poly(G)]4. Поворотная ось 4-го порядка совпадает с осью спирали, что приводит к параллельной ориентации заместителей при N9, т.е. Сахаров в гелях и сахарофосфатных цепей в полинуклеотидах.

ралей. В растворе гомополинуклеотиды имеют по крайней мере частично упорядоченную структуру, которая не могла бы сформироваться, если бы нуклеотидам в цепи не удавалось поддерживать стандартную конформацию [818, 930-932]. Упорядоченность сохраняется и в том случае, если разрушить возможный стэкинг, нагрев раствор, и, по существу, не меняется даже при апуринизации, приводящей к отщеплению почти половины оснований полидезоксинуклеотида [933]. Это предполагает, что упорядоченность структуры обусловлена не стэкингом оснований, а заторможенностью вращения вокруг связей в сахарофосфатном остове.

Структура синтетических гомополимеров

321

Гомополимеры-это не только синтетические модельные системы. Они обнаружены и в природных соединениях в виде участков poly(A) длиной ~200 нуклеотидов, которые ковалентно связаны с З'-концом молекул полидисперсной ядерной РНК и информационной РНК в клетках животных и во многих вирусах [934, 935].

К^к мы вскоре убедимся, структура гомополимеров гораздо более разнообразна, чем структура уотсон-криковских РНК и ДНК. Следовательно, образование комплементарных пар налагает на молекулу сте-реохимические ограничения, которые в конечном счете и определяют границы структурного многообразия двойных спиралей.

13.1. ПРАВЫЕ ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫЕ СПИРАЛИ СО СТЭКИНГ-

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕМ ОСНОВАНИЙ, ОБНАРУЖЕННЫЕ

У ПОЛИНУКЛЕОТИДА POLY(C) И У ЕГО 02-МЕТИЛИРОВАННОГО

АНАЛОГА

Давно известно, что гомополимер poly(C) находится в водном растворе в спиральном состоянии [930, 936-942]. Он образует две разные высо-коупорядоченные формы: одну при рН 7,0, другую при рН 4,5, вблизи рК цитидина. Было высказано предположение, что при низком рН образуется двойная спираль с параллельными цепями и наполовину про-тонированными парами СН + —С, показанными на рис. 13.1. По данным ИК-спектроскопии, такие пары действительно присутствуют как в растворе, так и в кристаллах [943]; об этом же свидетельствуют и результаты рентгеноструктуриого анализа монокристаллов цитозин-уксусной кислоты [944] и 1-метилцитозингидроиодида [945]. Результаты первых работ по рентгеновской дифракции на волокнах poly(C), полученных при рН 5 [ЮЗ], тоже указывали на образование такого комплекса, но более поздние рентгенограммы рассматривались как результат дифракции на одноцепочечной спирали [104]. Следует подчеркнуть, однако, что результаты этого более позднего исследования [104] не исключали возможности образования двойной спирали poly(CH + )-•poly(C). Такую спираль можно было бы идентифицировать по рентгенограмме волокна аммонийной соли poly(C), которая существенно отличалась от рентгенограммы одноцепочечной спирали poly(C). Однако рефлексы на такой рентгенограмме были слишком размытыми, чтобы можно было интерпретировать ее однозначно [104].

Одноцепочечная спираль poly{C) принадлежит А-семейству. Как видно из рис. 13.2, шесть нуклеотидов poly(C) образуют виток правой спирали. Расстояние между нуклеотидами вдоль оси спирали составляет 3,11 А. Сахара находятся в стандартной конформации С3.-эндо, значения торсионных углов указаны в табл. 9.3. Все эти параметры близки к таковым для А-РНК, за исключением угла вращения е вокруг связи С3.—03., который у poly(Q равен — 129°. Эта величина ближе к значениям е для мононуклеотидов, чем для двойных спиралей А-типа. Следовательно, в одноцепочечных спиралях стандартная конформация

509

322

Глава 13

Рис. 13.2. Структура одноцепочечной спирали ро1у(2'-0-метил-С), построенная по координатам, которые приведены в работе [947]. Кружки наибольшего диаметра отвечают метальным группам. Незамещенный полинуклеотид poly (С) имеет фактически такую же структуру. Описание деталей изображения и масштаб даны в подписи к рис. 10.1.

нуклеотидов сохраняется лучше, чем в стереохимически более жестких двойных спиралях. Угол наклона оснований в poly(C) довольно велик (ут = 21°, табл. 9.4) и не ложится на прямую, приведенную на рис. 9.4, откуда следует, что линейная зависимость между h и ух выполняется только для дуплексов с комплементарными парами оснований.

В одноцепочечной спирали poly(Q нет никаких других явных стабилизирующих факторов, кроме стэкинга оснований и стерических ограни-

Структура синтетических гомополимеров

323

чений, которые налагает стандартная геометрия нуклеотидов на геометрию сахарофосфатного остова. Неоднократно обсуждалась возможность образования водородной связи 02-—Н---04 между соседними нуклеотидами. Как показано в разд. 13.5, такая связь могла бы образовываться только при помощи водного мостика, поскольку расстояние ^2Н-04 много больше, чем ЗА.

Этот вывод подтверждают физические и структурные свойства полинуклеотида ро1у(2'-0-метил-С) аналога poly(C) с метилированными атомами 02 гидроксилов. Оба полимера имеют почти идентичные термодинамические и спектроскопические свойства [239, 946]. Как показывает рентгеноструктурный анализ волокон, структура ро1у(2'-0-ме-тил-С), по существу, повторяет структуру poly(C), только в данном случае на периферии одноцепочечной спирали располагаются метальные группировки [947] (рис. 13.2). Сахарные остатки находятся в конформации С3.-эндо, о чем свидетельствует величина угла 5 (табл. 9.3). Такой же результат был получен путем классических расчетов потенциальной энергии, выполненных для динуклеотидфосфата GpC [948].

' Однако в случае мономерного 2'-0-метилцитидина и теория [949], и кристаллографический эксперимент [950] приводят к другому результату -С2-эндо-конформации. Таким образом, фосфорилирование !ггома Оэ. и образование полимера могут менять конформацию сахарных остатков.

' Обсуждение структуры одноцепочечной спирали poly(C) было бы неполным, если бы мы не упомянули об одном недавнем исследовании. Методом ЯМР было

страница 38
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79

Скачать книгу "Принципы структурной организации нуклеиновых кислот" (9.68Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(16.09.2019)