й конформацией остается такая, при которой атом X располагается над фуранозным кольцом.

Мостик между вицинальными атомами кислорода 02 и Оэ гидроксильных групп рибозы. Нередко для предотвращения химической модификации рибонуклеозидов по атомам 02. и 03. гидроксилов, находя-

Модифицированные нуклеозиды и нуклеотиды

185

щихся в wuc-ориентации, осуществляют их блокирование или сшивание с помощью изопропила или другой, менее объемной группировки. Ци-клизованные таким путем нуклеозиды сохраняют прежнюю гибкость относительно связи С4.—С5., однако, как видно из табл. 7.1, амплитуда изгиба сахарного кольца vm может уменьшиться до такой степени, что рибоза становится плоской-ситуация, которая никогда на наблюдалась в кристаллических структурах немодифицированных нуклеозидов (рис. 7.1, Г) [172]. Отметим, что такая же плоская рибоза была обнаружена в случае цитидин-2',3'-0-циклофосфата (табл. 7.2). Это позволяет предположить, что циклизация типа 2',3'-0, как правило, стабилизирует планарную форму, являющуюся промежуточной между относительно плоскими конформациями С2--эндо и С3,-эндо, быстро переходящими одна в другую (что характерно и для немодифицированных нуклеотидов). По данным ЯМР, равновесие син *± анти смещено в сторону син [603, 605].

Нуклеозиды с фиксированной конфирмацией представляют собой уникальную систему для калибровки спектроскопических данных и проверки специфичности биологических систем. Из-за присущей нуклеозидам гибкости бывает очень трудно разграничить их структурные формы, опираясь на спектроскопические данные. Помимо равновесного перехода между разными конформациями сахара одновременно происходит вращение вокруг экзоциклической С4,—С5,- и гликозидной Сг—N-связей (разд. 4.13). Если все или одну из этих конформационных степеней свободы заморозить, то интерпретация данных ДОВ, КД и ЯМР станет более надежной [599, 603, 606-610]. Нужно, однако, иметь в виду, что химическая модификация, приводящая к образованию мостика между сахаром и основанием, может существенно изменить спектральные свойства системы.

Нуклеозиды с фиксированной конформацией-прекрасный инструмент для изучения специфичности ферментов, для которых нуклеозиды и нуклеотиды выступают в роли субстратов, ингибиторов или коферментов. Циклические нуклеозиды находят применение и в фармакологии [21, 588]. Было показано, что они обладают сильной противоопухолевой и противолейкозной активностью [611].

7.2. ЦИКЛИЧЕСКИЕ НУКЛЕОТИДЫ

Из природных циклических нуклеотидов наиболее важны те, в которых фосфодиэфирные группы образуют мостики между 2'- и 3'- или между 3'-и 5-атомами кислорода (рис. 2.2 и 7.3).

Нуклеозид-2',3'-0-циклофосфаты являются промежуточными продуктами гидролиза РНК рибоиуклеазами (РНКазами). Ферментативный гидролиз РНК осуществляется в два этапа. На первом происходит расщепление связи между атомами Р и О по механизму трансэтерификации, с образованием фрагментов РНК с 2',3'-0-циклофосфатом на конце. На втором этапе циклический фосфодиэфир гидролизуется с образованием

Таблица 7.2. Структурные характеристики некоторых циклических нуклеотидов

Химическая структура

Название соединения1' Конформация сахара

Параметры псевдовращения

Ориентация Ориентация относительно относительно гликозиднои связи С4—С5. связи (х) (у)

Р,

град

vmax» град

об-

об-

ласть град2' ласть град

Ссылка

(Н)

Цитидин-2',3'-0-циклофосфат, натриевая соль

А

Б

—, в виде свободной кислоты

04.-эндо-Плоская

Сг-эндо-

-С4.-экзо, °Т4 82 36

син син

63 75

ск an

56 162

-Сз-экзо, 2Т3

[618] [618]

174 29 анти -118 ск 69 [619]

О' е О

(12)

U

°х/°

s' е о

Уридин-2',3'-0-циклофосфотиоат, триэтиламмоний-ная соль

04.-экзо—С4.-эж)о, 0Т* 262 23

167 ск 74 [620]

1 -p-D-арабинозил-цитидин-^З'-О-циклофосфат, в виде свободной кислоты

Гуанозин-3',5'-0-циклофосфат, натриевая соль (циклический GMP)

Уридин-3',5'-0-циклофосфат, натриевая соль

А Б

5'-метиленаденозин-3',5'-циклофосфат

С2.-эндо—Су-экзо, 2Т3 171 42 анти - 154 ск 65 [621]

С^-экзо-Су-эндо, 4Т3 43 44

С4.-экзо-С3.-эндо, 4Т3 С^-экзо-Су-эндо. 4Т3

Су-эндо-С4.-экзо, |Т 37

78 - ск 61 [622]

42 48 анти - 103 - ск - 61 [623] 48 47 анти - 122 - ск - 60 [623]

54 - ск - 64 [624]

" А и Б-две независимые молекулы в асимметричной части элементарной ячейки.

2) В оригинальных работах, которые использовались при составлении этой таблицы, были даны значения углов 04—С\—Nt—C6(N9—С8). Исключение составляет работа [619] (третья строчка). Чтобы получить из них значения углов 04.—Ct—Nt—C2(N9—С4), которые используются теперь, к старым значениям прибавлялись или вычитались 180°. Приведенные значения х следует рассматривать как приблизительные ( + 3°).

188

Глава 7

концевого З'-О-фосфата [612]. Этот механизм хорошо изучен на примере панкреатической РНКазы и будет описан в разд. 7.5.

Нуклеозид-3,5-циклофосфаты, в частности пуриновые производные, выполняют разнообразные биологические функции. Аденозин-3',5'-цикло-фосфат (циклический AMP, сАМР) играет роль посредника между большой группой гормонов и регуляторными ферментами (протеинкиназа-ми) [613-615]. В бактериях сАМР участвует в регуляции экспрессии генов [616]. Как мы увидим в гл. 18, он образует комплекс с белком, активирующим катаболизм (БАК), и осуществляет аллостерическую регуляцию. Соответствующий гуанозиновый аналог отличается от сАМР по своей биологической специфичности и, по-видимому, оказывает противоположное действие на пролиферацию клеток и на другие клеточные процессы [617].

Геометрические характеристики природных нуклеотидов с 2',3'-и 3',5'-циклическими фосфодиэфирными группами, а также синтетического 2',5'-аналога приведены в табл. 7.2 (см. рис. 7.3). Как правило, эти молекулярные системы имеют ограниченные конформационные возможности и подобны циклическим нуклеозидам, описанным выше.

Нуклеозид-2,3 -О-циклофосфаты имеют уплощенную рибозу и преимущественно находятся в спн-конформации. Все кристаллографические данные о нуклеотидах, в которых вицинальные атомы 02- и 03. находящихся в цмс-ориентании гидроксилов образуют кольцо с помощью фосфодиэфирной связи, приведены в табл. 7.2 и на рис. 7.3, А. Поскольку в пятичленном кольце циклофосфата группа 02.—С2.—С3.—Оэ. практически планарна, «слитая» с этим кольцом рибоза в значительной мере теряет свою конформационную гибкость. Амплитуда изгиба сахарного кольца уменьшается, о чем свидетельствует планарность рибозы в производных цитидина (табл. 7.2) и низкие значения vmax (22-36°), существенно меньшие среднего значения (39°) для немодифицированных фу-ранозных колец [172]. Только в одном из 2',3'-0-циклических фосфатов, приведенных в табл. 7.2, сахар находится в С2'-эндо-конформации; во всех других случаях он имеет 04,-эндо- и даже во всех отношениях невыгодную 04.-экзо-конформацню конверта. Обе конформацни уплощенные и близки к конформацни сахара в 2',3'-0-изопропилидинадено-зине (табл. 7.1). Как мы упоминали в разд. 4.2, плоская и 04.-экзо-конформации стерически запрещены, поэтому очевидно, что циклические нуклеотиды представляют собой напряженные системы.

Данные ЯМР для уридин- и цитидин-2',3'-0-циклофосфатов. В отличие от цитидин-З'-фосфата химический сдвиг Н6 для указанных соединений не изменяется с увеличением температуры, что можно объяснить фиксацией пиримидин-2',3'-0-циклофосфатов в сын-конформации, которой соответствует энергетический барьер, равный примерно 25 ккал ¦ моль _ 1 [625-627]. Этот факт, согласующийся с результатами кристаллографических исследований (табл. 7.2), можно объяснить, допустив, что поворот оснований при переходе из син- в антм-конформацию сопровождается изгибанием группы С2.—Н2. вниз, что совершенно запрещено

Модифицированные нуклеозиды и нуклеотиды 189

Рис. 7.3. Молекулярная структура двух природных циклических фосфатов, конформационные параметры которых указаны в табл. 7.2. А. Цитидин-2',3'-0-цик-лофосфат в виде свободной кислоты [619]. Протонированное по атому N3 основание находится в ангаи-ориентации; из-за 2',3'-циклизации изгиб сахарного кольца незначителен и оно находится в С2.-эндо-С3.-экзо-конформации 2Т3. Б. Гуанозин-3',5'-0-циклофосфат-нуклеозид, в котором рибоза жестко фиксирована в С4.-экзо-С3.-эндо-конформации 4Т3. Основание находится в син-ориентации [622].

190

Глава 7

при наличии связи между вицинальными атомами 02- и 03. гидроксильных групп. Однако для пуриновых производных это положение не выполняется: основания у них более подвижны и постоянно переходят из син- в яниш-конформацию и обратно [605, 627, 628].

Конформация относительно гликозиднои связи влияет на ориентацию относительно экзоциклической связи С4.—С5.. По данным ЯМР, в пиримидиновых нуклеозид-2',3'-0-циклофосфатах, предпочтительно находящихся в смн-конформации, торсионный угол у относительно связи С4.—С5. находится в области an или -ск, а атом 05. направлен в сторону от наиболее близко расположенного атома основания 02. Для пуриновых производных предпочтительной является 4- ск-область; смн-конформация стабилизируется с помощью водородной связи 05,—H-N3 [627, 628].

Данные ЯМР указывают на то, что в циклических нуклеотидах осуществляется равновесный переход между конформациями сахара С2,-энсЪ и С3.-эндо. В свете результатов кристаллографических исследований, согласно которым в нуклеозид-2',3'-0-циклофосфатах наблюдаются планарные и С2.-эндо-конформации, наличие такого перехода представляется вполне логичным: амплитуда изгиба сахарного кольца Vmax' в циклических нуклеозидах меньше, чем в нециклических, а 04--эндо, 04.-экзо и плоская конформацни, являясь промежуточными формами перехода Сг-эндо <=s С3--эндо, стабилизируются при циклизации.

Теоретический анализ структуры нуклеозид-2',3 -О-циклофосфатов методом КВВМО [629] и полуэмпирическими методами расчета потенциальной энергии [630, 631] согласуется с экспериментальными данными и показывает, что, когда фуранозное кольцо находится в 04.-эн<)о-конформации, пиримидины предпочитают смн-конформацию. В пуриновых нуклеозидах син- и янтм-конформации встречаются одинаково часто, а ориентация относительно связи С4-—С5- соответствует + ск или an-области. Однако в нуклеозид-2',3'-0-циклофосфатах, в которых сахар находится в 04.-экзо-конформации, основания находятся только в янтм-ориентации относительно сахарного кольца. При этом поворот вокруг связи С4.—С5. с переходом в — ск- или яп-область перемещает атом 05. в сторону и от сахара, и от основания, с которыми из-за сближения экзоциклических заместителей в 04--экзо-конформации сахара может возникнуть стерически неблагоприятный контакт.

В нуклеозид-3',5'-циклофосфатах фураноза фиксирована в высокоэнергетической конформацни. Стереохимия этого класса нуклеотидов существенно отличается от стереохимии их 2',3'-циклических аналогов. В последних образование пятичленного фосфодиэфирного кольца заставляет располагаться атомы 02.—С2.—С3.—Оэ. практически в одной плоскости и приводит к уменьшению амплитуды изгиба фуранозного кольца и даже к планарности рибозы, связанной с фосфатным циклом. В циклических 3',5'-нуклеотидах фосфодиэфирная группа является частью

Модифицированные нуклеозиды и нуклеотиды

191

шестичленного кольца с фиксированной конформацией кресла. Это кольцо слито с рибозой через связь С3.—С4., так что единственной возможной конформацией для рибозы остается С4.-экзо—С3.-эндо (4Т3) (рис. 7.3, Б).

Значения эндо- и экзоциклических торсионных углов для шестичленного кольца в конформации кресла лежат в областях + ск и — ск, т. е. вблизи + 60°. Следовательно, поворот вокруг общей для обоих колец связи С3.—С4. должен приводить именно к этому значению. Препятствием служит то обстоятельство, что эндоциклический торсионный угол v3 (С2.—С3.—С4.—04.), который в незамещенных нуклеозидах принимает значения от 4- 33 до — 41°, может увеличиться только до 50°, и это соответствует максимальному изгибу рибозы с vmax 45° [172].

В кристаллических структурах циклических нуклеозид-3',5'-фосфатов [622, 623, 632, 633], включая и модифицированный аналог с 8-заме-щенным аденином [634], диметилфосфоамидат и бензилтриэфирные производные тимидин- и уридин-3',5'-циклофосфатов [635, 636], наблюдались как син-, так и антм-конформации. В одном случае-в кристаллах сАМР обе конформации реализуются в рамках одной кристаллической струюуры [632]. Эти наблюдения согласуются с данными ЯМР, которые указывают на наличие быстрого равновесного перехода син *± анти; в данном случае этот переход, по-видимому, облегчается тем, что атом 05. фиксирован в положении «от рибозы» в аи-области, а сахар находится только в С4.-экзо- или С3.-эндо-конформации [153, 637-642]. К таким же результатам приводят и теоретические расчеты [629, 630].

Циклический нуклеотид-это напряженная структура, о чем свидетельствуют его геометрия и энтальпия гидролиза. Длины связей в фосфатных группах нециклических диэфиров и циклических, с разным размером кольца, практически одинаковы и примерно равны значениям, приведенным на рис. 4.23; небольшие отклонения обусловлены различиями в окружении в кристаллической решетке. С другой стороны, валентные углы, особенно эндоциклические углы Р—О—С и О—Р—О, сильно зависят от размеров кольца. Как видно из табл. 7.3, эти углы в нециклических фосфодиэфирах и шестичленных циклических диэфирах очень близки. В пятичленных кольцах они меньше, а в семичленных системах больше, что свидетельствует о наличии механического напряжения. Судя по распределению энергии гидролиза фосфодиэфирных групп, циклические нуклеозид-3',5'-фосфаты менее напряжены, чем их 2',3'- и 2',5'-ана-логи. Однако энтальпия гидролиза 2',3'- и 3',5'-нуклеотидов дает обратную картину (табл. 7.3).

Это кажущееся несоответствие можно объяснить, если рассматривать не только валентные углы фосфатных групп, но также и конформацию слитых с ними фуранозных колец. Как видно из табл. 7.3, энтальпия гидролиза при переходе от циклического тетраметиленфосфата к его диметиленовому гомологу увеличивается; это увеличение связано с разной степенью стерического напряжения пятичленных колец. Слия-

192 Глава 7

Таблица 7.3. Энтальпия гидролиза —АН (ккал-моль-1) циклических и нециклических фосфодиэфиров1' [643, 645]

2,6 3,8 6,9

О

11,7 9,4

1} Большими цифрами обозначена энергия, маленькими—значения валентных углов О—Р—О и Р—О—С. Если указан только один угол Р—О—С, то это означает, что другой имеет близкое значение. Заметим, что значения энтальпии гидролиза диэтил-фосфата с открытой цепью и циклического тетраметиленфосфата практически одинаковы (2,5 и 2,6 ккал-моль-1); с уменьшением размеров циклическая структура становится более напряженной и параллельно этому увеличивается энтальпия. В циклических 2', З'-О- и 3', 5'-0-нуклеотидах дополнительное напряжение вносит фуранозное кольцо.

ние кольца с рибозой, происходящее в циклических нуклеозид-2',3'-фос-фатах, увеличивает энтальпию гидролиза на 2,5 ккал ¦ моль ~ 1; это указывает на дополнительное напряжение, вносимое фуранозной системой, которая, как отмечалось выше, принимает более уплощенную (и поэ