|
|
Принципы структурной организации нуклеиновых кислотзоксиполинуклеотидов наблюдается обратная ситуация: комплекс poly(dA) • poly(dT) более стабилен, чем чередующийся сополимер poly(dA—dT) • poly(dA—dT) [558]. Низкая 7^ последнего объясняется образованием коротких шпилек с пониженной термостабильностью. Поскольку РНК-аналоги также способны образовывать шпильки (это известно из данных по тРНК), то, по-видимому, различие в стабильности коррелирует с типом спиральной структуры, а не с нуклеотидным составом: для дезоксианалогов предпочтительными являются В-и D-типы спирали, тогда как рибополинуклеотиды могут существовать только в А-форме (гл. 9). Шпильки, малые и боковые петли. При оценке стабильности двухцепочечных РНК необходимо учитывать не только взаимодействие между соседними нуклеотидами, но и эффект образования разнообразных петель: шпилечных, малых и боковых [557-561] (табл. 6.10; рис. 6.21). Согласно имеющимся данным, боковые и малые петли более стабильны, 100 20 0,01 м ро// 0.001М ЭДТА / 0.15М NaCl* / 0.015М Цитрат Na / -1_d 60 100 110 Рис. 6.17. Зависимость температуры плавления Тт ДНК от GC-содержания [549]. Препараты ДНК готовили в буфере 0,15 М NaCl+ 0,015 М цитрат Na, рН 7,0. Точки 1 и 41, соответствующие poly(dA — dT) и poly(dG — dC), не ложатся на прямую Тт = 69,3 + 0,41 (%GC), проведенную через экспериментальные точки методом наименьших квадратов. (at) (GO (at) (1) Рис. 6.18. Схематическое изображение процессов денатурации и ренатурации двухцепочечных ДНК и РНК [550]. В первую очередь плавятся АТ-богатые участки. Силы, стабилизирующие ассоциаты оснований Таблица 6.9. Оценка стабильности двойной спирали ДНК [555] 167 (А) Матрица стабильности для спаренных динуклеотидов с геометрией В-ДНК 5' 3' А Т G С Т 36,73 54,50 54,71 86,44 А 54,50 57,02 58,42 97,73 С 54,71 58,42 72,55 85,97 G 86,44 97,73 85,97 136,12 11 Значения 7^, (в °С) приведены для 19,5 мМ Na4. (Б) Значения Тт, полученные исходя из данных табл. А, для ряда синтетиче- ских дезоксирибополинуклеотидов с заданной последовательностью Полинуклеотид эксперимент1* теория2' разность3' Poly (dA—dT) • poly (d A— 45,0 46,9 - 1,9 —dT) Poly (dA—dA—dT) • poly (dA— 49,2 49,4 -0,2 —dT—dT) Poly (dA)-poly (dT) 53,0 54,5 - 1,5 Poly (dG—dA—dA) - poly (dT— 64,5 66,5 -2,0 —dT—dC) Poly (dG dT—dA) • poly (dT— 66,8 64,3 2,5 —dA—dC) Poly(dA—dA—dC)- 70,2 69,0 1,2 •poly(dG dT—dT) Poly (dG—dA) • poly (dT—dC) 71,3 72,4 - 1,1 Poly (dG—dA—dT) • poly (dA— 72,0 66,1 5,9 —dT—dC) Poly(dG—dG—dA)- 76,3 76,9 -0,6 •poly(dT—dC—dC) Poly (dG—dT) • poly (dA—dC) 77,4 76,2 1,2 Poly (dG)- poly (dC) 87,8 86,0 1,8 Poly (dG—dC) • poly (dG—dC) 99,2 104,3 -5,1 11 Приведенные значения являются результатом интерполяции экспериментальных значений, полученных при разных ионных силах, к точке 19,5 мМ Na+. 21 Рассчитаны по данным табл. 6.9 (/4) с учетом частоты встречаемости ближайших соседей в каждом полимере. 3) Гт(эксп.)-Гт(теор.). чем шпилечные; оптимальный размер последних соответствует шести неспаренным основаниям. Следует подчеркнуть, что в двухцепочечных ДНК и РНК могут раскрываться как концевые пары, так и пары, расположенные внутри спи- 168 Глава 6 Таблица 6.10. Экспериментально полученные значения свободной энергии двухцепочечных участков и петель в РНК при 25~С1) [557] Участки со спаренными основаниями А-А- U-U- A-U- -U-A U-A -A-U -А-С--U-G- -С-А- -A-G- -G-A--G-U-'-U-C-'-C-U- -C-G--G-C- -G-C -C-G- G-G- ' С С- -G -и -и -G -G -X- -и -Y- AG (ккал) ± 10% -1,2 -1,8 -2,2 -3,2 -5,0 -0,3 Участки с неспаренными основаниями AG (ккал) + 1 ккал Число неспаренных оснований 2-6 7- 20 т(> 20) 1 2-3 4-7 8- 20 т(> 20) 3 4-5 6-7 8-9 10-30 т(> 30) Боковые петли + 2 + 3 1 + 2 log m Внутренние петли + 3 + 4 + 5 + 6 4 + 2 log m Шпилечные петли оканчивающиеся парой GC + 8 + 5 + 4 + 5 + 6 3,5 + 2 log те оканчивающиеся парой AU > 8 + 7 + 6 + 7 + 8 5,5 + 2 log т 11 Приведенные значения свободной энергии AG для участков со спаренными основаниями представляют собой изменение свободной энергии при присоединении одной пары к уже существующей спирали и поэтому определяются последовательностью только двух пар. Силы, стабилизирующие ассоциаты оснований 169 Рис. 6.19. Кривая плавления ДНК (вверху) и ее первая производная cL4/dT (внизу). Четко видны 9 пиков, каждый со своей собственной температурой, высотой и шириной. Представлены расчетные кривые; экспериментальные кривые приведены в работе [557]. 78 80 82 84 Температура. ° С Рис. 6.20. Корреляция между температурой плавления Тт, определенной экспериментально (табл. 6.9), и энергией стэкинга, полученной расчетным путем (табл. 6.8), для спаренных динуклеотидов с геометрией в-ДНК. Примечательно, что два разных подхода к одной и той же проблеме дают согласующиеся результаты, коэффициент корреляции между которыми составляет 0,97. Значения энергии, приведенные на графике, взяты из работы [536] и мало отличаются от тех, которые указаны в табл. 6.8 [555]. 170 Глава 6 -А-A" YJ ( U \ U . А I I А . U I I А . U I I G . С I I G . С I I ,U . А \ U У . А I I А . U I I А . U А . U / \ Внутренняя (J U С . Gv Боковая петля Внутреняя петля А . U/ I I U . А I I G . С I I С . G I I U . А I I U . А I I с и V У G . С I I G . С I I U . G б' V +6 -1,8 -1,2 -2,2 -5,0 -2,2 -1,2 + 3 -1,8 -1,2 -1,2 +2 -2,2 + 3 -1,8 -2,2 -3,2 "2,2 -1,2 -2,2 +2 -5 0 Рис. 6.21. Возможная вторичная структура фрагмента РНК вируса R17 длиной 55 нуклеотидов, построенная по данным табл. 6.10 и 6.11 [557]. Д^полн при 25°С равна — 21,8 ккал • моль ~ Уточненные и незначительно отличающиеся от приведенных данные представлены в работе [556]. ральных участков. Однако частота раскрытия в последнем случае (по данным для двухцепочечных олигорибонуклеотидов) довольно низка [563, 566] (табл. 6.11). Обычно GC-napa примерно в 100 раз более стабильна, чем пара AU; при этом важную роль играют и фланкирующие Силы, стабилизирующие ассоциаты оснований 171 Таблица 6.11. Вероятность раскрытия AU- и GC-nap в двухцепочечной РНК [561] Пара и ее окружение AG раскрытия центральной пары при 25°С, ккал-моль-1 Вероятность раскрытия С—G—G С—С—С 7,5 0,3-10~ 5 G—G—А С—с—и 6,75 1,2-10"5 А—G—G U—С—С 6,75 1,2-Ю-5 А—G—А и—С—и 6,0 4,2-10" 5 А—А—А и—и—и 4,0 120-10"5 A—A—G и—и—с 4,15 100-10 5 G—А—А с—и—и 4,15 100-Ю-5 G—А—G С—и—С 4,3 70-10"5 пары оснований. В молекуле РНК со случайной последовательностью длиной в 106 нуклеотидов при 25 °С примерно 10 GC-nap и 500 AU-nap не будут связаны водородными связями и не будут участвовать в стэ-кинг-взаимодействии с соседними парами. Из всего этого следует, что двухцепочечные нуклеиновые кислоты представляют собой не статичные цилиндрические структуры, а конформационно подвижные, «дышащие» объекты, реагирующие на любые химические модификации [563]. 6.9. ТАУТОМЕРИЯ ПАР ОСНОВАНИЙ И «КАЧАНИЕ»: СТРУКТУРНЫЕ АСПЕКТЫ СПОНТАННЫХ МУТАЦИЙ И ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД Если бы в живых организмах не происходило мутаций и спаривание оснований осуществлялось строго в соответствии с принципом Уотсона— Крика, то флора и фауна нашей планеты не были бы столь разнообразны. Модифицированная генетическая информация передается в ходе репликации последующим поколениям, затем подвергается транскрипции и трансляции, в результате чего синтезируются видоизмененные белки (рис. 6.22). Репликация, транскрипция, трансляция и генетический код. Наиболее важным моментом во всех трех процессах является узнавание основаниями друг друга в соответствии с принципом Уотсона—Крика, в ре- ДНК -> мРНК Репликация Транскрипции /А-Т/ \тРНК^ Белок Трансляция Образование комплементарной мРНК Ь 4Ь I Серии Тирозин Пролин Одна цепь Генетический код Рис. 6.22. Схематическое представление центральной догмы молекулярной генетики [584]. Двухцепочечная ДНК реплицируется и передается от одного поколения другому. Последовательность нуклеотидов в ДНК несет информацию о последовательности аминокислот в белке. Для того чтобы мог синтезироваться белок, ДНК транскрибируется с образованием информационной, или матричной, РНК (мРНК). Последовательность нуклеотидов в этой мРНК переводится на язык последовательности аминокислот (трансляция). Нуклеотидный триплет кодирует одну аминокислоту в соответствии с генетическим кодом (рис. 6.23). Трансляция осуществляется при участии транспортной РНК-молекулы-адапто-ра, которая содержит антикодон, комплементарный кодону в мРНК, и связывается с аминокислотой, специфичной данному антикодону. Рис. 6.23. Генетический код, представленный в радиальной форме [585]. Триплеты, кодирующие разные аминокислоты (их обозначения располагаются по периферии окружности), читаются от центра (5') к периферии (3')- Во всех триплетах первые два основания строго фиксированы, а последнее может различаться (вырожденность). Исключение составляют триплеты, кодирующие аминокислоты Тгр и Met. Аминокислоты, отмеченные звездочкой, встречаются дважды; точками и треугольниками указаны терминальные и инициирующие кодоны соответственно. Силы, стабилизирующие ассоциаты оснований 173 Рис. 6.24. Возможные механизмы возникновения случайных мутаций в АТ-паре при транзиции и трансверсии [566]. Аналогичную схему можно нарисовать и для GC-пары. Оба мутационных процесса проходят через образование редких таутомерных имино- и енольных форм оснований, которые на схеме обозначены звездочкой. В результате трансверсии образуется пурин-пуриновая пара, в которой одно основание находится в сын-конфор-мации, как это показано на рис. 6.25. Размеры пи-римидин-пиримидиновой пары слишком малы, чтобы она осталась незамеченной при коррекции. (По [570].) Непра-Пара вильная оснований пара Мутация А А* Т и а О) m и А Т А А* А С то а I- т G зультате которого осуществляются прямое копирование ДНК (репликация) и преобразование последовательности нуклеотидов в ДНК в соответствующую последовательность информационной РНК (транскрипция). В процессе трансляции информация, содержащаяся в мРНК (матричная, или информационная РНК) в виде последовательности нуклеотидов, транслируется на рибосомах в последовательность аминокислот. Аминокислоты поставляются на рибосому молекулами тРНК, выступающими в роли посредников [564]. Каждая специфическая тРНК содержит антикодон-определенную последовательность из трех нуклеотидов (триплет), которая узнает комплементарный ему кодон в молекуле мРНК, в результате чего к растущей полипептидной цепи присоединяется следующая аминокислота в соответствии с генетическим кодом (рис. 6.23). Последовательность аминокислот в полипептидной цепи полностью определяется последовательностью триплетов в мРНК, которая читается от 5'- к З'-концу. Образование пары, отличной от уотсон-криковской, может привести к мутации. Рассмотрим сначала процесс репликации ДНК. Случайные замены нуклеотидов, которые могут произойти в ходе этого процесса, бывают двух типов: 1) транзиции, когда пурин заменяется другим пурином или пиримидин-другим пиримидином; 2) трансверсии, когда пурин заменяется пиримидином и наоборот [565] (рис. 6.2^). Экспериментально наблюдаемая частота мутаций колеблется от Ю-8 до 10~ 11 на одну синтезированную пару [566]. Эти цифры указывают, как часто ускользает из-под двойного контроля со стороны ДНК-полимеразы синтез неправильных, отличных от уотсон-криковских пар. Фермент ДНК-полимераза перемещается вдоль молекулы ДНК в направлении 5' -» 3', присоединяя нуклеозидтрифосфаты к растущей новосинтезиро-ванной цепи ДНК, комплементарной цепи-матрице [567]. Правильность каждого шага синтеза проверяется и подвергается последующей коррекции. Если присоединенный нуклеотид будет признан неправильным, его вырежет из цепи смещающаяся в обратном направлении (3' -> 5') экзо-нуклеаза [568, 569]. 174 Глава 6 Обычная уотсон-криковскан пара G:C Качающаяся' пара оснований ^ G:U G*:T Рис. 6.25. Некоторые таутомерные не-уотсон-криковские пары, которые могут встречаться в схемах, изображенных на рис. 6.24. Подобные пары приводятся и в работе [570]. Редкие таутомерные формы оснований обозначены звездочкой. u.-i Рис. 6.26. Сравнение структуры уот-сон-криковской и «качающихся» пар. Отклонение от стандартной геометрии показано цветной стрелкой. Пары, состоящие из оснований в енольной или имино-формах, описаны в работе [580]. Силы, стабилизирующие ассоциаты оснований 175 Как отмечалось в разд. 5.3, примерно одно из каждых 104-|- 105 оснований находится в редкой таутомерной енольной или иминоформе, и это может приводить к образованию пар, отличных от уотсон-криков-ских (рис. 6.25). Если геометрия таких пар и уотсон-криковских пар одинакова, то при дупликации и коррекции эта пара может быть и не выявлена. Общую частоту мутаций можно оценить, перемножив концентрации редких таутомерных форм, присутствующих в исследуемой системе. Это дает величину 10~410_4Ч- 10"5-10'5, т.е. 10~810~ 10 мутаций на синтезированную пару, что соответствует экспериментальным данным [570]. Механизм транзиции и трансверсии различается. Для объяснения трансверсий был предложен несколько иной механизм (рис. 6.24). Он предполагает, что в результате трансверсии образуется не пурин-пири-мидиновая неправильная пара, а пурин-пуриновая. «Стандартная» пу-рин-пуриновая пара длиннее, чем пурин-пиримидиновая, и не может остаться незамеченной аппаратом репликации и коррекции. Поэтому предполагается, что в ней при присоединении к растущей цепи происходит анти -» сын-переход и она приобретает «нормальные» размеры. Это требует одновременного образования редких таутомерных форм указанных оснований (рис. 6.25). Анти -» син-переход уменьшает вероятность мутаций еще на 1-2 порядка, и суммарная частота мутаций становится равной 10— 10 Ч- 10— 12 трансверсий на один присоединенный нуклеотид, что опять-таки согласуется с экспериментом [570, 571], «Качание» оснований: мутации и узнавание тРНК-мРНК. Образование редких таутомерных форм оснований хорошо объясняет природу мутаций в ДНК, связанных не только со случайной заменой нуклеотидов, но и с включением, например, 5-бромурацила и 2-аминопурина (т. е. природу химических мутаций). С другой стороны, в некоторых случаях, по крайней мере при образовании неправильных GT-nap, возникновение мутации можно объяснить простым несоответствием партнеров, без привлечения редких таутомерных форм. Эта так называемая гипотеза «качания» оснований была предложена Криком [572] и в дальнейшем подтверждена экспериментально [573-576]. Гипотеза «качания» была выдвинута для объяснения вырожденности генетического кода, который переводит информацию с языка нуклеотиднои последовательности |
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 |
Скачать книгу "Принципы структурной организации нуклеиновых кислот" (9.68Mb) |
[каталог] [статьи] [доска объявлений] [обратная связь] |