Биологический каталог




Принципы структурной организации нуклеиновых кислот

Автор В.Зенгер

ой денатурации динуклеозидфосфатов выявили «скрытое» положительное изменение энтропии, замаскированное общим отрицательным изменением энтропии [507, 536, 537]. По всей видимости, механизм 1 вносит более существенный вклад в стэкинг, чем механизм 2, и многочисленные эксперименты показывают, что гидрофобные силы играют здесь очень важную роль [512, 538, 539].

Специфичность стэкинга определяется диполь-дипольиыми взаимодействиями и лондоновскими дисперсионными силами. С помощью гидрофобных сил нельзя объяснить некоторые аспекты специфичности взаимодействия оснований: почему, например, пурины образуют более

158

Глава 6

стабильные стопки, чем пиримидины, или почему метилирование усиливает стэкинг-взаимодействие? Все эти особенности связаны с электронной структурой оснований и определяются главным образом лондонов-скими дисперсионными силами и диполь-дипольными взаимодействиями.

Как было показано Лондоном [540], вандерваальсовы силы притяжения между атомами при их сближении в основном определяются электрокинетическими взаимодействиями между системами. Распределение заряда в группах атомов всегда асимметрично. Диполь, образовавшийся в одной группе атомов, приводит к поляризации электронной системы соседних атомов или молекул, индуцируя тем самым образование параллельно ориентированных диполей, которые притягиваются друг к другу. Эти силы аддитивны и обратно пропорциональны шестой степени расстояния между диполями. Они не зависят от температуры и пропорциональны произведению поляризуемостей взаимодействующих молекул [541]. Поскольку основания обладают еще и собственным дипольным моментом, два типа электронных эффектов-лондоновские дисперсионные силы и взаимодействие между постоянными диполями-дают весьма заметный эффект, который в пуринах проявляется сильнее, чем в пиримидинах.

Спаривание оснований путем образования водородных связей зависит от состава пары оснований, тогда как стэкинг зависит как от состава, так и от последовательности; результаты квантово-химических расчетов. Электростатические силы, действующие между основаниями в стопке и в паре, по самой своей природе связаны с распределением заряда, и их можно изучать квантово-химическими методами. Первые грубые оценки, полученные в рамках диполь-дипольного приближения, были затем уточнены с учетом монополь-монопольных, поляризационных и дисперсионных взаимодействий, а также отталкивания, представленного членом 1/г12 в уравнении (3.5) Леннард-Джонса [483, 484, 489, 537, 542, 543].

Данные, которые приводятся в табл. 6.8 для десяти возможных комбинаций пар оснований GC и AT в стопках, были получены в рамках геометрии В-формы ДНК (гл. 11). Если разложить полную энергию стабилизации димеров, образованных из разных пар оснований, на горизонтальную (спаривание) и вертикальную (стэкинг) составляющие [484, 542], то мы увидим, что горизонтальное комплементарное спаривание оснований путем образования водородных связей, зависящее только от состава пары, является более важным, чем вертикальный стэкинг, который зависит как от состава, так и от последовательности оснований.

Поскольку GC-пары более стабильны, чем AT (табл. 6.5), стопки из димеров с высоким GC-содержанием энергетически более выгодны, чем АТ-богатые стопки. Так, энергия стэкинга для стопок

с g g • с

Силы, стабилизирующие ассоциаты оснований

159

Таблица 6.8. Полная энергия стэкинга (ккал на моль димера) в десяти возможных димерах с геометрией В-ДНК, полученная в результате квантово-химических расчетов1' [542]

Димер, образовавшийся в результате стэкин- Энергия стэкинга, ккал на га пар оснований моль димера

1g-c1

га та

га mi

IogI

Ig-cI Ic-g1

га

It-a! 1c-g1

tG-ci tt-ai

It-a1 Ic-gI

11 Стрелки указывают направление сахарофосфатного остова (5' -»3') от С3.-атома одного сахарного остатка к С5.-атому следующего. Эти атомы углерода связаны друг с другом фосфодиэфирной связью.

различается на 8 ккал • (моль димера) ~1. Влияние последовательности оснований на энергию стэкинг-взаимодействия подчиняется следующей общей закономерности:

3'

пиримидин • пурин 3. пурин-пиримидин^ f

более стабилен, чем

> пурин • пиримидин

3 пиримидин, пурин 5,

Например, энергия комплексов

1g-c[ и 1c-g[

различается на 5 ккал на моль димера (табл. 6.8). Природа корреляции между энергией и нуклеотиднои последовательностью становится по-

160

Глава 6

нятной, если рассмотреть геометрию перекрывания основании при стэ-кинге (рис. 9.6). В чередующихся пурин-пиримидиновых последовательностях перекрывание между соседними основаниями в стопке определяется двумя типами последовательностей:

5пиримидин з пурин

или

J пурин

3'пиримидин

Перекрывание в таких димерах сильно отличается по геометрии от перекрывания в тех случаях, когда соседними основаниями в цепи являются только пурины или только пиримидины.

Следует подчеркнуть, что данные, представленные в табл. 6.8, получены для условий in vacuo и не учитывают гидрофобных взаимодействий, которые, однако, существенным образом влияют на стэкинг. По результатам экспериментов, которые обсуждаются в следующем разделе, был определен суммарный вклад спаривания оснований и стэкинга в стабильность спиральных олиго- и полинуклеотидов в водных растворах.

6.8. ОБРАЗОВАНИЕ И РАЗРУШЕНИЕ ДВОЙНОЙ СПИРАЛИ ПРОИСХОДЯТ КООПЕРАТИВНО

Спираль, в которой основным повторяющимся мотивом является один виток, можно считать одномерной кристаллической решеткой. Формальная аналогия между спиралью и кристаллом проявляется и в их физических свойствах: разрушение обеих структур происходит кооперативно, при строго определенной температуре (плавление), а рост начинается после образования зародыша (нуклеации).

Кооперативный механизм образования спирали (механизм «застежка-молния») требует наличия зародыша, состоящего из трех пар оснований. На рис. 6.11 показана схема образования двойной спирали между poly(A) и poly(U). Первым шагом этого процесса является образование единственной пары AU с константой ассоциации, равной произведению параметра нуклеации Р (10 ~3 л-моль" *) на параметр роста цепи s (равный примерно 10 при 0°С и 1 при температуре плавления); оба параметра определяются по данным релаксационной кинетики. Поскольку образование первой пары зависит от параметра р\ эта пара довольно нестабильна; образование же второй пары, вступающей в стэкинг-взаи-модействие с первой, зависит только от константы s и поэтому протекает легче. Третья пара, укладываясь в стопку над первыми двумя, формирует зародыш, из которого путем добавления новых пар шаг за шагом создается спираль, аналогично тому, как застегивается «молния» [544].

Энергетический профиль этого процесса схематически изображен на рис. 6.12. Образование первой изолированной пары невыгодно и сопровождается увеличением свободной энергии системы. После формирова-

Силы, стабилизирующие ассоциаты оснований

161

А I

А

А I

А

А I

А I

А I

I I A U /~ \ A U I

U I

U

А I

А

I А

I

А I

А I

I

А Г А /-А (

А I

А (

А I

А

I

I

U I

U \

и I

и

и I

и I

и I

I I

A U

1-1 A U

1-1 A U /- \

и

А I

А

А I

А I

A U 1-1

A U 1-1

A U 1-1

A U

/- \

I I A_U

A U 1-1 A U I- I A U I- I A U /- N

А I I I

А I

Образование Образование зародыша двойной спирали

Рис. 6.11. Схематическое изображение процесса образования двойной спирали oligo (А) - oligo (U) [544]. В этой системе параметр роста спирали s равен примерно 10 при 0°С и 1 при температуре плавления. Константа ассоциации К первой пары равна Ps, и, поскольку параметр нуклеации р равен 10 ~3 л-моль-1, эта константа очень мала. Однако образование следующей пары происходит с константой К = s в соответствии с линейной моделью Изинга. В противоположность изодесмической модели процесса образования стопок оснований (рис. 6.9), согласно которой каждый гааг не зависит от предыдущего, в кооперативной модели Изинга образование пар и стэкинг очень сильно зависят от ближайшего соседа. Исключение составляет только самый первый шаг-образование первой пары.

ния зародыша (стопки из трех последовательных пар оснований), который, однако, все еще легко разрушается, добавление новой пары становится выгодным и сопровождается уменьшением свободной энергии. С этого момента рост двойной спирали проходит самопроизвольно и определяется в основном геометрическими ограничениями, налагаемыми на сахарофосфатный остов стереохимией нуклеотидного звена: наиболее предпочтительной оказывается как раз та конформация, которая соответствует спиральной структуре. Этому же процессу способствуют образование водородных связей и стэкинг, и все указанные факторы совместно обусловливают кооперативность образования спирали и ее разрушения (плавления).

Одним из параметров, характеризующих двойную спираль, является ее температура плавления Тт. Образование стэкинга сопровождается уменьшением поглощения УФ-света (гипохромизм; рис. 6.13); поэтому, наблюдая за спектром поглощения в этой области, удобно следить за образованием и разрушением двойной спирали. Если медленно повышать температуру раствора двухцепочечной ДНК (или РНК), то при определенной температуре будет наблюдаться резкое увеличение поглощения, обусловленное разрушением спиральной структуры. Среднюю точку такого перехода называют температурой плавления (Тт). На рис. 6.14 приведены кривые плавления двухцепочечных молекул oligo(A) - oligo(U) разной длины. Видно, что с увеличением длины цепи

II -509

162

Глава 6

Свободная энергия -

-10

-6

-8

-2

-4

+2 -

О

220

240

260

280 нм

Рис. 6.12. Зависимость полной свобод- Рис. 6.13. Спектры поглощения нативной энергии системы (в произвольных ной двухцепочечной ДНК (1), денату-единицах) от числа пар, участвующих рированной ДНК (2) и мономерных в стэкинг-взаимодействии и включив- нуклеотидов (3), стэкинг между ко-шихся в спираль [544]. После преодо- торыми отсутствует (концентрация ления энергетического барьера нуклеа- мономеров такая же, как в нативной ции последующий рост спирали со- ДНК). В денатурированной ДНК все провождается уменьшением свобод- еще сохраняется значительный стэкинг ной энергии и процесс протекает само- [185]. произвольно.

Тт растет и кривая становится более крутой, указывая на увеличение кооперативное™ [545-547].

Переход спираль-клубок в двухцепочечных структурах осуществляется по принципу «все или ничего». Анализ системы A(pA)17U(pU)17 при разных температурах (рис. 6.15) показывает, что она либо полностью диссоциирована и представляет собой смесь мономеров, либо имеет форму непрерывной двойной спирали, в которой процесс быстрой диссоциации-ассоциации затрагивает лишь пары, расположенные у концов.

7^, двухцепочечных нуклеиновых кислот растет не только с увеличением их длины, но и с повышением ионной силы раствора и СС-содержа-ния полинуклеотида (рис. 6.16, 6.17). Поскольку в первом приближении нуклеотидный состав связан с температурой плавления линейной зависимостью, его можно оценить по величине 7^,. Из характера указанной зависимости следует, что АТ(и)-богатые участки двухцепочечных ДНК или РНК со случайной последовательностью плавятся при более низких

Силы, стабилизирующие ассоциаты оснований Гиперхромизм (290 нм)

163

50

Темлерэтурэ, ° С

Рис. 6.14. Кривые плавления двойных спиралей oligo (А) ¦ oligo (U) разной длины-от 8 пар оснований до со [545]. Тт бесконечно длинного дуплекса poly (А) ¦ poly (U) равна примерно 49°. По оси ординат отложена величина 100 ¦ (?т — ?„)/?„, где ?т- поглощение при данной температуре, ?к - поглощение полностью денатурированной ДНК. Измерения проводились при длине волны 290 нм. Концентрация олигонуклеотидов составляла 5+11,3 мМ; плавление проводили в 50 мМ Na-какодилатном буфере, рН 6,9.

температурах, чем GC-богатые (рис. 6.18), т.е. в двойной спирали при повышении температуры образуются локально денатурированные участки [550]. Все это приводит к тому, что спектр времен релаксации для процессов плавления оказывается чрезвычайно широким [544, 550]. Профиль дифференциальной кривой плавления (т.е. зависимость величины А А/AT от температуры) не является гладким, а содержит множество пиков, каждый из которых отвечает выплавлению конкретного участка двойной спирали с определенным GC-содержанием [551-554] (рис. 6.19).

В результате анализа множества профилей подобных кривых была получена «матрица стабильности» для спаренных динуклеотидов с геометрией В-ДНК, позволяющая оценить значения Тт каждого из спаренных динуклеотидов при определенных условиях (табл. 6.9, А). По данным табл. 6.9 можно рассчитать температуру плавления Тщ двухце-почечной ДНК с любой последовательностью оснований. Некоторые примеры такого рода приведены в табл. 6.9, Б. Если построить график

и*

164

Глава 6

0.6 0,5 0,4 0.3 0,2 0,1 0,0

0,2 0,1 0,0 0,5 0,4 0.3 0,2 0,1

'''''''''

i

0,0

г=о,о с

s = 6,21

012345678 9 101112131415161718

Г = 16,9°С s = 3,8

012345678 9 101112131415161718

Г=23,5°С s = 3

.llll

Рис. 6.15. Анализ поведения системы А(рА)17 U(pU)17 при разных температурах [548]. Произведение (Параметр нуклеации Р) • (концентрация с), которое использовалось в этом анализе, равно 10 ~ 1. Заметим, что концевые пары легко раскрываются и схлопываются, в результате чего наблюдается распределение спиралей по длинам лишь в интервале от 13 до 18 пар оснований. Спирали длиной от 1 до 12 пар практически отсутствуют; они либо диссоциируют, либо переходят в класс спиралей с длиной цепи от 13 до 18 пар.

01 2345678 910 1112131415161718

0,8-0,7-0,6 0,5 0,4-0,3-0,2 0.1 0.0

Т= 28,1 X s = 2,6

01 2345678 9 101112131415161718

Число образовавшихся пар оснований

зависимости температуры плавления дуплекса, рассчитанной по данным табл. 6.9, от энергии стэкинга, полученной квантово-химическими методами (табл. 6.8), то мы с удивлением обнаружим, что он является линейным (рис. 6.20). Экспериментальные и теоретические данные согласуются между собой, хотя при теоретических расчетах не учитываются гидрофобные эффекты, стерические ограничения, наличие положительных ионов вокруг фосфатных групп, гидратация и т.д. По-видимому, все эти эффекты взаимно компенсируются.

Используя олигорибонуклеотиды с заданной нуклеотидной последовательностью в качестве модельных соединений, удалось установить, как меняются термодинамические параметры при присоединении или отщеплении одной пары оснований от предсушествующей спирали [554-557]. Ис-

Силы, стабилизирующие ассоциаты оснований 165

65 70 75 80 85 90 95 100 105

Температура." С

Рис. 6.16. Плавление ДНК из D. pneumoniae (R-36A) при разной ионной силе [549]. Ионную силу варьировали путем изменения концентрации КС! в цитрат-ном буфере, рН 7,0.

ходя из данных табл. 6.10, можно сделать вывод, что зависящая от нуклеотидного состава и последовательности оснований стабильность РНК-дуплексов уменьшается в следующем порядке: poly(G)• poly(Q > >poly(G—C)poly(G—C)> двойная спираль со случайной последовательностью >poly(A—U)poly(A—U) > poly(A) • poly(U). Такой порядок для (А/и)-полимеров является несколько неожиданным, поскольку для аналогичных де

страница 19
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79

Скачать книгу "Принципы структурной организации нуклеиновых кислот" (9.68Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.08.2019)