ответствующих природных аналогов. Особый интерес представляют так называемые «качающиеся» пары оснований, которые будут обсуждаться в разд. 6.9.

Таблица 6.5. ?„олн Д1"1 некоторых пар оснований, полученная методами квантовой химии [484]

Пары оснований" ? ?пол Ета1 еполн

Комплементарные уотсон-криковские и хугстеновские пары

С—С (XIX) - 14,10 - 1,90 -0,79 - 16,79

А—Т (XX) -5,7 -0,57 -0,73 -7,00

А—Т (XXI) - 5,47 -0,64 -0,86 -6,97

A—U (XX) - 5,68 -0,66 -0,87 -7,21

A—U (XXIII) -4,93 -0,70 -0,98 -6,61

A—U (XXIV) - 5,26 -0,64 -0,95 -6,85

Самокомплементарные пары

А—А (V) -4,40 -0,49 -0,71 -5,60

U—U (XII) -4,13 -0,61 -0,68 -5,42

G—G (III) - 13,71 - 1,72 -0,61 - 16,04

С—С (XIV) -8,61 - 1,41 -0,71 - 10,73

Некомплементарные пары

A—G (VIII) -7,68 - 1,02 -0,70 -9,40

G—U (XXVIII) -6,08 -1,12 -0,67 -7,78

1( Римские цифры в скобках указывают на тип спаривания основании в соответствии с рис. 6.1.

Силы, стабилизирующие ассоциаты оснований

151

6.5. вертикальные взаимодействия между основаниями

Основания укладываются друг над другом, образуя высокие стопки наподобие стопок монет. «Горизонтальная» ассоциация оснований, обусловленная образованием водородных связей, наблюдается в неводных растворах, а также в газообразном и кристаллическом состояниях. Помимо этого, в твердой фазе основания почти всегда располагаются параллельно одно над другим на расстоянии вандерваальсового радиуса ~ 3,4 А. Такое расположение является результатом не горизонтальных, а вертикальных взаимодействий. Стопки образуются и в водных растворах. Поскольку стэкинг играет важную роль в стабилизации спиралей нуклеиновых кислот [488, 489], мы рассмотрим его основные геометрические и термодинамические параметры, а также силы, лежащие в основе подобных взаимодействий (см. обзор [448]).

В двух сравнительных исследованиях [490, 491] упаковка оснований в комплексах с переносом заряда была сопоставлена с упаковкой в неполярных ароматических соединениях, таких, как бензол, нафталин, антрацен и фенантрен. Неполярные ароматические соединения не обладают дипольным моментом и в кристаллической решетке располагаются в виде «елочки», в которой соседние молекулы не параллельны, а перпендикулярны друг другу. Если, однако, в молекулу антрацена или фенантрена ввести атом азота, как это имеет место в молекулах акридина и этидия, то у нее появится дипольный момент; в результате молекулы в кристалле будут располагаться параллельно, образуя стопки.

Специфичность стэкинг-взаимодействия. Расположение оснований в виде стопок преобладает и в кристаллических структурах [490, 491]. При этом оказывается, что стэкинг-взаимодействие между основаниями довольно специфично: полярные заместители одного основания, —NHa<-

=N—, ==0 ИЛИ ГаЛОГеНЫ^наВИСаЮТ над_арпмятичрг-кнш упп!.ттпм.-?'™'РГ'-

непГоснования (рис. 6.8). Такого рода специфичность стэкинга дажеТю-лее вьфаженаТчем специфичность при образовании водородных связей. Рассмотрим, например, кристаллы дезоксиаденозинмоногидрата [492], аденозин-5'-фосфата [493], аденозин-5'-бромурацила [494] и дезоксигу-анозин-5'-бромдезоксиуридина [398]. Во всех случаях пространственная группа кристаллов, размеры элементарной ячейки, молекулярная упаковка и система водородных связей различаются; и тем не менее пурины вступают в стэкинг-взаимодействие по одной и той же схеме, представленной на рис. 6.8, А Специфичность стэкинга проявляется и в галогензамещенных основаниях. Атомы галогенов располагаются над примыкающими ароматическими гетероциклами на расстоянии, даже меньшем чем сумма вандерваальсовых радиусов для атомов галогена и атомов гетероцикла (рис. 6.8, И).

Анализ кристаллических структур некоторых нуклеозидов и нуклеотидов указывает на наличие тесного межмолекулярного контакта между атомом 04. сахара и примыкающим гетероциклом (рис. 6.8, А, К). Be-

Рис. 6.8. Схемы стэкинг-взаимодействия между основаниями в кристаллах различных соединений (рисунок заимствован из статьи [491]). А. Стэкинг, наблюдающийся в кристаллах дезоксиаденозинмоногидрата [492], аденозин-5'-фосфа-та [493] и в комплексе аденозин—5-бромуридин [494]. Б. Стэкинг между протонированными пуринами (9-метиладениндигидробромид) [415]. В. Стэкинг в кристаллах гуанозина и инозина [495]. Г. Влияние галогенового заместителя на стэкинг в случае 8-бромгуанозина [496]; сравните со схемой В. Д-Ж. Взаимодействие между амино- или кетогруппами и пуриновыми или пиримидиновы-ми основаниями: Д-9-этилгуанин-1-метил-5-фторцитозин [497]; Е-цитозин-моногидрат [498]; Ж -9-этиладенин-1 -метилурацил [499]. 3. Перекрывание пиримидинов с участием эндоциклического атома азота урацила [500]. И. Влияние галогенового заместителя на стэкинг между пиримидиновыми основаниями в кристаллах 5-бромуридина [501] и 5-фтор-2'-дезоксиуридина [502]. К. Взаимодействие рибозного кольца с пиримидином (цитидин) [503].

Силы, стабилизирующие ассоциаты оснований

153

роятно, в основе взаимодействий такого рода лежит низкая электроотрицательность атома 04. (разд. 5.1), что приводит к тесному сопряжению с it-электронной системой гетероцикла.

В кристаллах некоторых протонированных пиримидиновых оснований и нуклеотидов стэкинг не наблюдается вообще. Это позволяет думать, что заряженные пиримидины не вступают в стэкинг-взаимодействие. В случае протонированных пуринов стэкинг тем не менее имеет место, но носит другой характер, чем у незаряженных пуринов: атом N нависает над атомом N7 примыкающего основания (рис. 6.8,Б).

Анализ типов стэкинга в кристаллах оснований, нуклеозидов и нуклеотидов показывает, что главную роль в стабилизации стэкинга играет, по-видимому, взаимодействие между постоянными и индуцированными диполями; в роли постоянного диполя, влияющего на л-элект-ронную систему соседнего основания, выступают группы С=0 и С—NH2 [491].

6.6. ТЕРМОДИНАМИКА СТЭКИНГ-ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

Процесс образования стопок аддитивен н лимитируется диффузией; в его основе лежат слабые взаимодействия. Осмометрическими методами [448, 504] было показано, что в водных растворах основания и нуклеозиды образуют ассоциаты при помощи вертикальных взаимодействий, причем помимо димеров образуются ассоциаты более высокого порядка (рис. 6.9). Как показали седиментационные измерения, этот процесс обратим. Увеличение свободной энергии на всех этапах одинаково, откуда следует, что присоединение основания к другому основанию или к стопке оснований носит аддитивный, некооперативный характер, так что процесс можно считать изодесмическим [505]. Приведенные в табл. 6.6 данные для пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов в водном растворе указывают, что 1) значения констант ассоциации К характерны для слабых взаимодействий; 2) энтальпия АН и энтропия AS отрицательны; 3) изменение стандартной свободной энергии AG по порядку величины не превышает энергию теплового движения кТ (0,6 ккал моль ~ *); 4) метилирование оснований обычно приводит к небольшому увеличению стэкинг-взаимодействия.

Структуру стопок в водном растворе исследовали также методом ЯМР [506, 507]. При образовании стопки из двух гетероциклов протоны каждого основания подвергаются разэкранирующему эффекту за счет магнитной анизотропии, обусловленной кольцевыми токами соседнего основания. Вследствие этого с увеличением концентрации гетероциклов наблюдается сдвиг линий резонанского поглощения для протонов в сторону сильных полей (рис. 6.10). Относительный сдвиг для протонов оснований и Сахаров в пуриновых нуклеозидах показывает, что в стэкинге принимает участие шестичленное пиримидиновое, а не пятичленное имидазольное кольцо и что ориентация гетероцикла в стопке зависит от типа основания, т.е. от его амино- и кето-замести-

154

Глава 6

+

Рис. 6.9. Формирование стопок оснований в водной среде начинается с образования димера [544]. Дальнейшую ассоциацию можно рассматривать как изо-десмический процесс, т.е. каждый следующий шаг не зависит от предыдущего и все они характеризуются одинаковыми кинетическими и термодинамическими параметрами.

тел ей [448]. Заметного уширения линий при ассоциации не наблюдается, откуда следует, что образование и разрушение агрегатов происходят слишком быстро по временным масштабам, характерным для ЯМР. Как показывают измерения поглощения звука, процесс агрегации, изображенный на рис. 6.9, лимитируется только диффузией [508].

Пурин-пуриновые стопки наиболее стабильны. Исследование растворимости в двухфазных системах и данные ЯМР показывают, что интенсивность стэкинг-взаимодействия между пуриновыми и пиримидиновы-ми основаниями уменьшается в следующем порядке [509-513]:

Пурин—Пурин > Пиримидин—Пурин > Пиримидин—Пиримидин.

В олиго- и полинуклеотидах стэкинг между соседними основаниями приводит к формированию стабильной одноцепочечной спиральной структуры [514]. Стабильность таких спиральных структур подчиняется таким же закономерностям, что и указанные выше: при комнатной температуре poly(A) представляет собой в основном спиральную структуру, a poly(U) находится преимущественно в состоянии разупорядоченного клубка.

Образование спиральной структуры одноцепочечными олигомерами

Силы, стабилизирующие ассоциаты оснований

155

Таблица 6.6. Термодинамические параметры самоассоциации (стэкинга) нуклеозидов и оснований в водном растворе [448]

Соединение К, л-моль 1 дн, ккал-моль-1 AS, э.е. AG, ккал ¦ моль-1

6-метилпурин 6,7 - 6,0 ± 0,4 - 16 - 1,12

Пурин 2,1 - 4,2 + 0,2 - 13 -0,44

Рибозилпурин 1,9 - 2,5 + 0,1 -7 -0,38

Дезоксиаденозин от 4,7 до 7,5 - 6,5 + 1,0 - 18 - 1,00

Цитидин 0,87 - 2,8 ± 0,1 - 10 0,08

Уридин 0,61 - 2,7 ± 0,1 - 10 0,29

Тимидин 0,91 - 2,4 ± 0,3 -9 0,06

можно представить как простой переход между двумя состояниями

[514-522]:

Спираль (стэкинг-взаимодействие)«^Разупорядоченный клубок (стэкинг отсутствует)

Термодинамические параметры этого процесса для некоторых олигонуклеотидов приведены в табл. 6.7. АЯ, AS и Тт для ApU и АрА практически одинаковы; по-видимому, указанные выше правила, определяющие зависимость стэкинга от последовательности оснований, для таких коротких олигонуклеотидов не выполняются. Вместе с тем для димера СрС в соответствии с этими правилами стэкинг существенно меньше. Как отмечалось ранее (табл. 6.6), при алкилировании оснований стэкинг увеличивается; об этом свидетельствует повышение Тт с увеличением степени метилирования (табл. 6.7).

Предложенный ранее более сложный механизм образования структуры АрА, основанный на данных ЯМР [516] и результатах кинетических экспериментов [517], в дальнейшем подвергся серьезной критике [520]. Полученные недавно данные по круговому дихроизму и ЯМР вновь подтвердили, что модель двух состояний вполне адекватна. Эти же данные показали, что в спиральных олигорибонуклеотидах сахар находится в С3.-эндо-конформации. В спиральных олигодезоксирибонук-леотидах преобладает С2'-эндо-конформация, причем для концевого

Таблица 6.7. Термодинамические параметры стэкинга в некоторых ди-нуклеозидфосфатах XpY

Соединение AH, AS, кал-К-1-

ккал ¦ моль-1 ¦моль-1

АрА [522] - 8,5 + 0,5 - 28,5 + 1,5 26,2 + 3

СрС - 8,5 ± 0,5 - 30,0 ± 1,5 13,3 ± 5

ApU - 7,3 + 0,5 - 24,7 + 1,7 22,0 + 1,1

m6ApU - 7,4 ± 0,3 - 24,8 ± 0,9 26,9 ± 0,9

m| ApU [518] - 6,5 + 0,2 - 20,9 ± 0,7 36,7 ± 0,8

АрА -7,2 ±0,3 - 24,5 + 0,9 21,9 ± 0,9

m* Apm| A - 6,7 ± 0,2 - 21,1 + 0,7 44,5 + 0,8

156

Глава 6

.2' -0-Метиладенозин

-Метил 2 -дезоксиаденозин

-Диметиладенозин

0,06 0,10 0,15 0,20 0,25 Моляльная концентрация

Рис. 6.10. Стэкинг оснований можно наглядно продемонстрировать с помощью ЯМР и путем измерения давления паров над разбавленным раствором [506]. А. Из зависимости химического сдвига протонов оснований от концентрации оснований можно оценить константу ассоциации образующихся стопок. Все спектры Ng-диметиладенозина в D20 были получены при температуре 10СС. Б. Зависимость осмотического коэффициента ф для разных нуклеозидов в водном растворе от моляльной концентрации т. По таким кривым можно вычислить константы ассоциации и рассчитать свободную энергию образования соответствующих комплексов. Обратите внимание на сильную зависимость ф от метилирования оснований.

З'-нуклеотида наблюдается быстрый равновесный переход С2,-эндо Су-эндо [519]. Этот эффект должен приводить к расширению спектра конформационных состояний, и в свете этих новых данных следовало бы пересмотреть кинетические данные и данные ЯМР [516, 617].

6.7. СИЛЫ, СТАБИЛИЗИРУЮЩИЕ СТЭКИНГ ОСНОВАНИЙ: ГИДРОФОБНЫЕ СВЯЗИ И ЛОНДОНОВСКИЕ ДИСПЕРСИОННЫЕ СИЛЫ

В формировании стэкинга участвуют диполь-дипольные взаимодействия и л-электронные системы. Кроме того, имеются данные, что определенный вклад в стэкинг вносят лондоновские дисперсионные силы

Силы, стабилизирующие ассоциаты оснований

157

[488, 489], а в водных растворах еще и гидрофобные силы [523, 524]. Как эти силы действуют?

Стэкинг оснований стабилизируется энтропийными факторами; льдопо-добная вода и водные полости. В водном растворе основания стремятся объединиться в агрегаты и тем самым уменьшить контакты с растворителем. В предельном случае это приводит к образованию двухфазных систем. Для биологических макромолекул гидрофобные силы особенно важны: способствуя взаимодействию между неполярными боковыми группами аминокислот в белках и между основаниями в нуклеиновых кислотах, они вносят существенный вклад в стабилизацию вторичной и третичной структуры этих молекул [525-528]. Хотя значимость гидрофобных сил несомненна, их природа до сих пор остается предметом споров [529].

Агрегация молекул в водных растворах может происходить по двум причинам.

1. Если молекулы воды группируются у поверхности (гидрофобной) неполярной молекулы, образуя структуру, похожую на структуру льда [530], то энтропия системы при этом уменьшается, и с этой точки зрения такая ситуация является невыгодной. Если же растворенные молекулы агрегируют друг с другом, то суммарная поверхность, контактирующая с водой, уменьшается. Это приводит к высвобождению молекул структурированной воды, к увеличению ее энтропии и к стабилизации агрегатов [531-533].

2. Чтобы противодействовать силам поверхностного натяжения воды, растворенной молекуле выгодно образовать в воде полость. Если агрегируют две (или больше) растворенные молекулы, размеры полости увеличиваются. Это приводит к уменьшению площади поверхности, контактирующей с водой, и, следовательно, к уменьшению поверхностного натяжения, что в свою очередь ускоряет процесс агрегации [534, 535].

Какой из этих двух механизмов лежит в основе стэкинга? Как видно из табл. 6.6, образование стэкинга оснований в водном растворе является процессом экзотермическим и сопровождается отрицательным изменением энтропии, что вроде бы свидетельствует против механизма 1. Однако исследование системы актиномнцин-дезоксигуанозин в водном растворе в присутствии метанола, а также изучение процесса теплов