ность [467], выражающаяся в том, что 10-13% молекул 1-метилтимина повернуты на 180° вокруг оси С6—N3. На возможность образования такой структуры указывал в своей оригинальной

Силы, стабилизирующие ассоциаты оснований

143

работе сам Хугстен [469]. Одновременное присутствие хугстеновских и обратных хугстеновских пар оснований (структуры XXIII и XXIV на рис. 6.1) можно объяснить симметрией 1-метилтимина: поворот на 180° приводит к тому, что место атома 04 занимает атом 02, при этом система водородных связей сохраняется. Картина, обратная только что описанной, наблюдается в комплексе 1-метил-5-бромурацил—9-этиладе-нин (5-метильную группу тимина замещает атом брома). В этом случае только 6% молекул 1-метил-5-бромурацила принимают участие в хуг-стеновском спаривании, а остальные 94% спариваются по обратному хугстеновскому типу [470]. Можно было бы предположить, что конфигурацию пары определяет изменение электронной структуры пиримидина, обусловленное заменой тимина на бромурацил. Однако в кристаллах комплекса 1-метил-5-фторурацил—9-этиладенин наблюдается только хугстеновское спаривание, так что определяющим фактором, по-видимому, является кристаллическая упаковка и стэкинг между основаниями [471].

6.4. ОБРАЗОВАНИЕ ПАР ОСНОВАНИЙ С ТОЧКИ ЗРЕНИЯ ТЕРМОДИНАМИКИ, КИНЕТИКИ И ЗАКОНОВ КВАНТОВОЙ ХИМИИ: ЭЛЕКТРОННАЯ КОМПЛЕМЕНТАРНОСТЬ

Для определения констант ассоциации оснований, а также энтальпии и энтропии этого процесса использовались термодинамические методы. Спаривание оснований в водной среде представляет собой относительно малоэффективный процесс, поскольку за донорные и акцепторные группы, способные к образованию водородных связей, конкурируют молекулы воды. В результате возможно лишь качественное описание процесса. Слабопольный сдвиг сигналов от аминогрупп в спектрах ЯМР различных 5'-нуклеотидов позволил расположить эти нуклеотиды в порядке уменьшения их способности к ассоциации (образованию пары) [204]:

GMP с CMP > UMP > IMP » AMP,

AMP с UMP ~ CMP »IMP, GMP,

CMP с GMP~CMP>UMP>XMP, AMP, IMP

Рис. 6.3,A Уотсон-криковское спаривание в кристаллах GpC (вверху) и ApU (внизу) [465, 466]. Координаты атомов водорода взяты не из экспериментальных данных, а рассчитаны исходя из расположения других атомов. Различия в длинах водородных связей N—Н---0 (2,86-^2,95 А) и N—H---N (2,824-2,95 А) находятся в соответствии с данными табл. 6.2 и отражают «гибкость» подобного типа взаимодействий. Расстояние между атомами Сг (10,4-^10,72 А) и углы С,.•••С,.—N (примерно 53°) в этих парах практически совпадают и лежат в основе их геометрического изоморфизма. Б. Схема, иллюстрирующая изоморфизм и псевдосимметрию уотсон-криковских пар.

144

Глава 6

Рис. 6.4. Хугстеновская пара оснований 9-этиладенин—1-метилтимин. Данные получены с помощью метода нейтронного рассеяния, позволяющего локализовать атомы водорода [467]. Обратите внимание на различие в значениях углов Cj.---Cj.—n (56 и 44°) и относительно небольшое расстояние Сг---Сг (8,645 а). Водородные связи nh---0 и nh---n обозначены пунктиром

Силы, стабилизирующие ассоциаты оснований

145

Для количественного исследования процесса ассоциации оснований необходимо использовать неполярные растворители, в которых роль водородных связей возрастает, а стэкинг между основаниями становится пренебрежимо малым [204]. В ряде работ исследовались основания, содержащие замещенный гликозидный азот, с использованием в качестве растворителей тетрахлорметана, хлороформа и диметилсульфокси-да. За ассоциацией оснований следили по изменению сигналов ЯМР аминогрупп и по изменению их ИК-спектра (рис. 6.5) [472, 473]; применялись также калориметрические и осмометрические методы.

В растворе образуется смесь уотсон-криковских и хугстеновских пар оснований, в которых имеются как минимум две водородные связи и используются все потенциальные донорные и акцепторные группы. Как следует из данных, представленных на рис. 6.6, константы ассоциации оснований сильно зависят от химической природы взаимодействующих партнеров. В ряду комплексов типа 9-этиладенин—1-циклогексилурацил 3-метилурацил вообще не образует комплекса с аденином. Это означает, что для образования димера недостаточно одной водородной связи между аминогруппой аденина и карбонильным кислородом урацила; для этого необходимы по крайней мере две водородные связи (циклический димер). Очевидно, что константа ассоциации зависит от кислотности водородных атомов иминогруппы урацила (табл. 5.4): при низкой кислотности (например, в случае 5,6-дигидро-1-циклогексилурацила; рК = 11) наблюдается слабая ассоциация оснований, а при высокой (например, в случае 5-бромпроизводного, рК = 7,8)-сильная. В 4-тиоураци-ле (рК = 7,4) эффект высокой кислотности уравновешивается слабой акцепторной способностью атомов серы.

Интересно сравнить константы ассоциации при образовании комплекса между 1-циклогексилурацилом и тремя представителями ряда

9- этиладениновых производных: 9-этил-6-метиламинопурином, 9-этил-2-аминопурином и 9-зтиладенином (рис. 6.6). Константа ассоциации с последним соединением (100 л - моль ~ *) вдвое выше, чем с первыми двумя (50 и 45 л моль ~*). Это может означать, что аденин связывается с производными урацила и по схеме Уотсона-Крика, и по схеме Хугстена (пары оснований XX и XXIII на рис. 6.1). Статистическое преимущество перед последними двумя соединениями обеспечивается наличием двух способных к образованию водородных связей групп. Разграничить обычные и обратные уотсон-криковские и хугстеновские пары оснований не удается, так что все данные по ассоциатам AU относятся к смеси указанных пар оснований.

Свойства водородных связей с атомами Ог и 04 урацила определяются электроотрицательностью последних. Смесь пар оснований AU изучали методом 13С-.ЯМР по изменению сигналов от атомов С2 и С4 карбонильных групп в производных 1-циклогексилурацила при образовании ими комплекса с 9-этиладенином в хлороформе (система, аналогичная изображенной на рис. 6.6). Оказалось, что частота связывания с атомом 04 уменьшается, а с атомом 02 увеличивается в следующем

10- 509

146

Глава 6

700 600 500 400 300-

к - U 1 1 1 1 I 1 1 1 1 1 1

/ \ /^Ч / "\

* 1 / ч / х / л

J 1 / \ Л \ / \ ?\ f\ -\

у \ /1 / \\

\ / V V j II 1 / \ \ а

/ V \ / V \ / \ i —

1 л «\

/ 6 \ \ V

_ ' \ б\.—

1

ii 1

1 |(расч.

II

W

-

А 1 л |\ | % эксп

- /\ А lfY\ j \\ в -

/ \ / / \

.J ^ у в У V_L

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 i 1 1 г 1

* 80

? 60 -

40

0,6

о 0,4 -

* 0,2

3600

3400

3200 3600 3400 3200

Волновое число, см~"1

3600

3400

3200

Рис. 6.5. Эффект ассоциации оснований. Вверху: спектры ПМР 9-метилгуанина (G), 1-[7-15>1]метилцитозина (С) и их эквимолярной смеси (G + C) в растворе дейтерированного диметилсульфоксида/диметилформамида (DMF) [472]. 15N-замещенный цитозин был использован для того, чтобы в спектре выявился дублет С—15NH2, который иначе не был бы виден на фоне сигналов от протонов ароматической группы. Спектры получены на спектрометре Varian А-60; по оси абсцисс отложен химический сдвиг (в Гц) в сторону слабых полей относительно эталонного соединения ТМС (тетраметилсилана). Внизу: ИК-спектры 2,6-диами-но-9-этилпурина (А), 1-циклогексил-5-бромурацила (Б) и их эквимолярной смеси (В) [473]. Во всех случаях растворителем является 0,002 М дейтерированный хлороформ. В верхней части каждого из рисунков приведены спектры пропускания чистого растворителя (а) и исследуемого раствора (б). В нижней части приведены разностные спектры поглощения (в). Пунктирная кривая г является суммой кривых в, приведенных на рис. А и Б; разность между ней и экспериментальной кривой в прямо указывает на наличие водородных связей в комплексе.

Силы, стабилизирующие ассоциаты оснований

147

ряду [474]:

тимин, урацил, 5-бромурацил, 4-тиоурацил.

В таком же порядке уменьшается электроотрицательность атома 04; 5-метильная группа тимина отталкивает электроны, и электроотрицательность атома 04 увеличивается, тогда как 5-бром притягивает электроны, что приводит к обратному эффекту. Это последнее обстоятельство помогает понять, почему включение 5-бромуридина в ДНК

о

З-Метил урацил 0*С>*

R

"Yll О

урацил

цро-'f ^2,9

Й

5-Бром

урацил 0«C.N

f?

1 i *

R

0

YY4-

Иод-урацил

о

^ J v

6- Амино-8-бромпурин

120

Рис. 6.6. Константы ассоциации (л-моль-1) различных производных 1-циклоу-рацила и 9-этиладенина (в дейтерированном хлороформе при 25°С) [473]. Данные получены с помощью ИК-спектроскопии (см. подпись к рис. 6.5). Числа у стрелок-это константы ассоциации соответствующих производных аденина и урацила, а числа, расположенные справа от структурных формул соединений,— константы самоассоциации. А. Ассоциация 9-этиладенина с производными урацила. Б. Ассоциация 1-циклогексилурацила с производными аденина.

148

Глава 6

приводит к мутациям с нарушением спаривания оснований. Если атом 02 образует водородную связь с большей вероятностью, чем атом 04 в противоположность тому, что имеет место в тимидине, то совершенно очевидно, что для образования пары G—5-BrU (пара XXVIII на рис. 6.1) 5-бромурацилу совсем не обязательно переходить в редкую таутомерную форму, чтобы геометрия этой пары стала подобна геометрии пары GC [475].

При повышенных концентрациях могут образоваться олигомерные мультиплеты оснований. В обычных условиях комплекс AU представляет собой димер, а не тример или олигомер более высокого порядка. То же самое относится и к самоассоциатам UU и АА. Об этом свидетельствует наличие в ИК-области полосы с vmax = 3490 см " \ которая отвечает свободному атому водорода N—Н-группы аденина. Если бы и уотсон-криковские, и хугстеновские центры связывания были заняты (рис. 6.7), эта полоса отсутствовала бы. Комплексы из двух, трех и т.д. оснований образуются при повышенных концентрациях [476]. Среди них наибольший интерес представляет тример, состоящий из одной цепи poly(A) и двух цепей poly(U)-poly(A)-2 poly(U) (см. гл. 10).

Данные по термодинамике образования гомо- н гетерокомплексов с участием четырех оснований приводятся в табл. 6.3 [476-480]. Очевидно, что константы связывания и энтальпия сильно зависят от природы растворителя. Ясно также, что самоассоциаты менее стабильны, чем комплементарные AU- и GC-пары. Однако уменьшение энтропии во всех случаях примерно одинаково (от — 11 до — 16 э. е.), что указывает на сходство общей структуры всех ассоциатов: комплексы стабилизируются по крайней мере двумя водородными связями. Если считать, что вся энтальпия спаривания, составляющая примерно 6 ккал на 1 моль димера обусловлена только образованием водородных связей,

Рис. 6.7. В тримере А ¦ 2U основание А образует одновременно и уотсон-криковские, и хугстеновские водородные связи. #-атомы азота, О-атомы кислорода, жирные линии-гликозидные связи. На этом рисунке изображены только нормальные уотсон-криковские и хугстеновские пары, которые формируются в тройной спирали poly (А) ¦ 2poly (U) (разд. 10.2). Если учесть, что существуют еще и обратные пары, можно представить четыре возможные схемы расположения оснований в тримере.

Силы, стабилизирующие ассоциаты оснований

149

Таблица 6.3. Термодинамические параметры комплементарного спаривания и самоассоциации оснований путем образования водородных связей

Соединения, раствори- D ^асс> — Ай, — AS,

"еакция _, _,

тели и методы л • моль ккал ¦ моль э. е.

Гуанозин, цитидин G + G +± G2 0,18 1,0+ 1

в диметилсульфокси- С + С+±С2 0,1 1,7 + 1,5

де, ЯМР, 32°С [477] G + C^GC 3,7 + 0,6 5,8 16

9-этилкенин, 1-цикло- А + А «± А2 3,1 + 0,3 4,0 ± 0,8 11,4 + 2

гексилурацил в и + U *i и2 6,1 ± 0,6 4,3 + 0,4 11,0 + 1

хлороформе, ИК, A + U*±AU 103 + 36 6,2 ± 0,6 11.8 + 1,2

25°С [478]

1 -метилпиримидин, А + U +± AU 14,5

9-метилпурин в ва- G + C^GC 21,0

кууме, масс-спектро- и + и^и2 9,5

метрия [480]1} с + с *± с2 16,0

" Более полные данные см. в кн.: ВеркинБ.И. и др. Взаимодействия биомолекул: новые экспериментальные подходы и методы.-Киев, «Наукова думка», 1985.

то на каждую водородную связь будет приходиться от 2 до 3 ккал-моль" '-величина, как раз и ожидаемая для такого типа взаимодействий (табл. 6.1). Однако расчет, проведенный для условий in vacuo, дает величину 7 ккал • моль ~1 [480].

Ассоциация пар лимитируется диффузией. Кинетику ассоциации оснований исследовали путем измерения затухания ультразвука на примере системы 9-этиладенин - 1-циклогексилурацил в хлороформе. Скорость образования дуплекса как в случае гомо-, так и в случае гетерокомплек-са, по существу, лимитируется только диффузией и одинакова во всех трех случаях [481] (табл. 6.4). Однако скорость диссоциации для комплекса AU меньше, чем для комплексов А А и UU; это означает, что относительная прочность водородной связи уменьшается в ряду AU, АА, UU. К такому же выводу приводит и сравнение соответствующих констант ассоциации.

Таблица 6.4. Константы скорости ассоциации и диссоциации 9-этиладенина и 1-циклогексилурацила в хлороформе [481]

Реакция Константа Ассоциация, МОЛЬ-1'С-1 скорости Диссоциация, с-1 Температура, °С

и + и*±и2 1,5 109 25 + 107 25

А + А<± А2 >2109 > 60-107 25

А + U +± AU 4,0-109 3,2 - Ш7 20 АН= - 6,1

ккал • моль-1

150

¦ Глава 6

Квантово-химические расчеты показывают [482-485], что основным фактором при специфическом взаимодействии оснований является электронная комплементарность. Результаты таких расчетов для некоторых комбинаций оснований представлены в табл. 6.5. Сравнение вкладов дисперсионных сил (Едисп), поляризации (?Пол) и электростатических эффектов (Еэл) в полную энергию водородных связей четко показывает, что наиболее существенный вклад (примерно 80%) вносит ?эл, т. е. водородные связи в основном имеют электростатическую природу. Анализ зависимости ?ПОлн от состава пары свидетельствует о том, что стабильность таких комплексов зависит не только от числа водородных связей, но и в значительной степени от внутренней электронной структуры оснований. Этот факт был установлен ранее на основе измерения констант связывания и назван электронной комплементарностью [473].

Сравнение ?Полн для различных пар приводит к выводу, что комплементарные уотсон-криковские пары более стабильны, чем самоассоциаты индивидуальных компонентов. Все некомплементарные пары типа AG и GU менее стабильны, чем соответствующие самоассоциаты. Этот факт объясняет, почему некомплементарные пары не кристаллизуются. Исключение составляют замещенные основания, например 5-фторура-цил, образующий комплекс с цитозином [486, 487]. У таких оснований электронная структура изменена, вследствие чего энергия связывания для них отличается от таковой у со