систему, содержащую только две «виртуальные связи», и, таким образом, не рассматривать каждый торсионный угол в отдельности, то расчеты существенно упростятся. Каждый блок состоит из цепочки атомов, Р5.—05.—С5-—С4. и С4.—С3-—Оэ.—Р3., которые у нуклеотидов обычно находятся в транс(шт ант««ерииланарнои)-конфигура-ции, что позволяет считать каждую из них планарной системой. Виртуальные связи Р5.•••С4. и С4.•••Р3-, соединяющие атомы фосфора

8*

116 Глава 4

C2'-3«dO,Cg' "ЭНдО

360° 300° _ (С4.-С5) 1 у + ск оЯ R L Л 1 \ \ \ \ ч- Л» N V4^ ) к ' V

V----S

240"

О 1 180° О. an * R ч0 L 0 °Ч \ Л \ 1

е

120°

60° - — ск 8S R L 1 \\ \ V N i W L \ ' V

I I I — X____ 1 1

0° 60° 120° 160° 240° 300° 360°

Л ? (P-03.)

Рис. 4.29. А. Схема, иллюстрирующая области стерически разрешенных конформацни для одноцепочечных полинуклеотидов [383]. Сахар принимает одну из двух конформаций-С2-эндо (сплошная линия) и С3.-эндо (пунктир); торсионный угол у(С4.—С5.) соответствует трем заторможенным конформациям в областях + ск, — ск и ап. а и ? изменяются от 0 до 360°. Чтобы не загромождать рисунок, приводятся контурные линии, соответствующие только п = 8 и /г = 0, где и-число нуклеотидов на виток, a ft-расстояние между остатками вдоль оси спирали. Параметры, отвечающие двойным спиралям уотсон-криковского типа, соответствуют углам а и К,, равным — 60° (300°). Эти области выделены цветом.

с атомом С4., образуют виртуальные валентные и торсионные углы, что позволяет построить как спиральную полимерную структуру, так и полимерную структуру в состоянии разупорядоченного клубка и сопоставить эти структуры с экспериментальными данными [380, 389].

Необычная Х-ДНК: можно ли предсказать существование такой структуры теоретически? Говоря о левозакрученной двухцепочечной

Структура оснований, Сахаров и фосфатных групп

117

а' -РНК

Рис. 4.29. Б. Более детальная, чем на рис. 4.29. А, схема, на которой представлена зависимость п/п для одноцепочечного полинуклеотида [381]. Сахар в этом полинуклеотиде находится в Cj.-эндо-конформации, у лежит в + ск-области, р и е-в аи-области, % соответствует анты-ориентации. а и 5 изменяются от 0 до 360°. Числа на кривых изо-n (пунктирные кривые) и изо-ft (сплошные кривые) указывают число нуклеотидов на виток спирали и расстояния между остатками вдоль оси соответственно, h = 0 А отвечает спирали, выродившейся в прямую. Для правой спирали h положительно, а для левой отрицательно. Каждая из п-изолиний дважды пересекает каждую из й-изолиний, что дает области R\, Яц и Lj, Ln для правых и левых спиралей. Самой предпочтительной среди них является область й[, где имеют место наиболее благоприятные взаимодействия основание основание и сахар-основание между соседними нуклеотидами. Ri-темная, а Яд-светлая области над изолинией ft = 0. L[ и La- соответственно темная и светлая области под изолинией ft = 0.

118

Глава 4

Таблица 4.6. Конформационные параметры правой и левой двойных спиралей В-типа, полученные путем расчета потенциальной энергии1' [391]

Правая Левая

Торсионные углы остова и угол вра- а 302° (314°) 270°

щения вокруг гликозиднои связи Р 144° (214°) 135°

У 41° (36°) 36°

6 149° (156°) 137°

е 228° (155°) 241°

С 202° (264°) 204°

X - 106° ( - 100°) 177°

Эндоциклические торсионные углы v0 - 33,7° ( - 34,8°) -38,6°

фуранозы Vi 18,7° (33,3°) 18,1°

v2 6,3° (- 18,6°) 11,2°

v3 - 30,0° ( - 4,0°) - 36,1°

v4 40,5° (24,7°) 35,2°

Параметры оснований, определение ко- eR - 4,0° ( - 1,0°) 0,0°

торым дано на рис. 2.14 - 7,5° ( - 6,0°) -3,0° .

D — 0,30( —.0,14) A - 1,22 A

" Считается, что сахар находится в С2. -эндо- коиформации, а угол у лежит в об

ласти + ск. Числа в скобках получены из данных по дифракции на волокнах В-ДНК.

Z-форме, которую может образовать полинуклеотид poly[d(G—С)] с чередующейся последовательностью, необходимо отметить следующее. Повторяющейся единицей в такой структуре является динуклеотид (гл. 12), поэтому, беря за основу мононуклеотид, предсказать существование Z-ДНК невозможно. Соответствующий анализ можно провести, однако, увеличив размер повторяющейся единицы до динуклеотида или более [390, 391]. Можно попытаться даже рассмотреть единицы с разной нуклеотиднои последовательностью; такая ситуация наблюдается при исследовании тонкой структуры кристаллов додекамерного фрагмента ДНК (разд. 11.2).

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ

Основные положения гл. 4 можно суммировать следующим образом.

1. Азотистые основания планарны. Они находятся в кето- и амино-тау-томерных формах. Из-за резонанса аминогруппы не могут выйти из плоскости гетероциклов, причем энергетический барьер вращения аминогрупп равен ~ 15 ккал-моль-1.

2. Сахарный остаток-рибоза либо дезоксирибоза-находится в С2.-эн<)о (S)- или С3.-эндо (М)-конформации. В растворе между этими конформациями поддерживается динамическое равновесие. Быстрый переход от одной конформацни к другой происходит в соответствии с циклом псевдовращения, с образованием промежуточной

Структура оснований, Сахаров и фосфатных групп

119

04.-эндо-конформации. Разность энергий двух состояний невелика: по теоретическим оценкам она составляет 0,6-3,8 ккал моль-1, а экспериментально наблюдаемая величина равна 4,7 ккал-моль-1. Положение равновесия С2--эндо +± Су-эндо определяется электроотрицательностью заместителей при атомах С2. и С3. (из-за гош-эф-фекта более электроотрицательный заместитель предпочитает аксиальную ориентацию) и ориентацией оснований (син-ориентация оснований чаще всего сочетается с С2.-эно"о-конформацией сахара). В составе спиральных полинуклеотидов это равновесие «замораживается»: сахар присутствует либо в С2.-эндо-, либо в С3.-эно'о-конформации (табл. 4.7).

3. Пиримидиновые нуклеозиды, как правило, находятся в аншм-ориен-тации относительно гликозидной связи Cr—N, тогда как в случае пуриновых нуклеозидов анти- и смн-конформации встречаются одинаково часто. В растворе между этими двумя конформациями наблюдается быстрый равновесный переход. Снн-конформация стабилизируется взаимодействием 05.—H--N3 (пурины) и 05.—Н--02 (пиримидины), а также наличием объемных заместителей при атомах С8 (в пуринах) и С6 (в пиримидинах). Исследование кристаллов некоторых (модифицированных) нуклеозидов позволило обнаружить высокую-анти( — ск '-конформацию с углом %, лежащим вблизи — 100°. 5'-нуклеотиды и полинуклеотиды находятся в аншм-конфор-мации, однако гуанин столь же часто оказывается в смн-ориентации.

4. Нуклеозиды предпочитают конформацию с торсионным углом у, находящимся в области +ск. Конформации, в которых этот угол лежит в областях — ск и an, встречаются редко. Для 5'-нуклеотидов преобладающей является + ск-конформация, которая стабилизируется водородной связью (основание) С—Н-05.; эта связь влияет также на соотношения между син- и антм-ориентациями основания (табл. 4.7).

5. Фосфатная группа имеет тетраэдрическую конфигурацию. Длина связей Р—О меняется от 1,5 А для связи Р—О ~ до 1,6 А для связи Р—Оэфир. Это различие обусловлено разным вкладом я-электронов из-за перекрывания 3dx2-yr- и Зя^-орбиталей атома фосфора с 2р-орбиталями атома кислорода; по этой же причине валентный угол О—Р—О увеличивается от 105 до 120°. Длина связей Р—О—Р в пирофосфатной группе равна 1,6 А, а валентный угол--130°, однако геометрия связи «обычная». Дополнительная энергия «богатых энергией» пирофосфатных групп обусловлена отталкиванием фосфатов и гидратацией фрагментов, образующихся при разрыве связи.

6. Ориентация фосфатных групп относительно связей С—О такова, что для С5—05.-связи угол Р лежит в области an, а для связи С3.—Оэ. угол е немного смещается в сторону больших углов (220°), в область —ак.

7. В нуклеозидах все торсионные углы, кроме угла у, связаны между собой. В полинуклеотидах угол у тоже не является независимым.

Таблица 4.7. Предпочтительные коиформации нуклеозидов и нуклеотидов

Тип нуклеозида или нуклеотида Конформация сахара (5) X Cr—N У Ст- с5. Р с5.-о5. е С3-О3. Р—О,. Р—О;

Нуклеозиды

Пиримидиноиые

Рибо С3.-эндо/С2.-эндо анти/син ек/- ск/ап

Дезоксирибо С3.-эндо/СТ-эндо анти/син ск/- ск/ап

Пуриновые

Рибо С3,-эндо/С2.-эндо анти/син ск/- ¦ ск/ап

Дезоксирибо С3.-эндо/С2.-эндо анти/син ск/- ¦ ск/ап

У-нуклеотиды

Пиримидиновые

Рибо С3.-эндо/С2.-эндо анти ск an (180°) -ак (220°)

Дезоксирибо С3.-эндо/С2.-эндо анти ск an (180°) -ак (220°)

Пуриновые

Рибо С3.-эндо/СТ-эндо анти ск an (180°) - ак (220°)

Дезоксирибо С3.-эндо/С2.-эндо анти ск ал (180°) - ак (220°)

Спиральные полинуклеотиды

Рибо С3.-эндо анти ск ал (180°) - ак (220°) — ск — ск

Дезоксирибо Сз.-эндо/СТ-эндо анти ск an (180°) - ак (220°) — ск — ск

Преобладающие конформацни подчеркнуты. По номенклатуре ск, — ск и an-это + гош, — гош и транс соответственно.

Структура оснований, Сахаров и фосфатных групп

121

Это означает, что структурные изменения происходят согласованно.

8. Из-за гош-эффекта торсионные углы а и определяющие ориентацию относительно эфирных связей Р—05. и Оэ.—Р, лежат в основном в областях + ск и — ск. В одноцепочечных полинуклеотидах ориентация относительно связей Р—О такова, что углы а и ? лежат строго в областях — ск либо anj — ск или в области — ск/ап, а в спиральных структурах со спаренными основаниями и а, и ? лежат только в области — ск.

9. Для спирали из нуклеотидов в стандартной («жесткой») конформации с углами х, У, Р, е в областях анти, + ск, an (180°), — ак (220°) и с сахаром в С2.-эндо- или С3.-эндо-конформации можно рассчитать спиральные параметры: и (число нуклеотидов на виток) и h (расстояние между нуклеотидами вдоль оси спирали) для разных значений углов а и График зависимости n — h показывает, что имеется только одна область, соответствующая спиральному состоянию молекулы. Гладкие лево- и правозакрученные конфигурации разделены прямой й = 0 А, которая соответствует структуре типа лестницы. При весьма незначительных вариациях углов а и ? знак спирали может измениться Правые спирали встречаются чаще из-за более тесных горизонтальных и вертикальных контактов между соседними нуклеотидами.

10. Для предсказания структуры полимеров, находящихся в спиральном состоянии и в виде статистического клубка, используется понятие «виртуальная связь»; в его основе лежит представление о полинук-леотиде как о последовательности блоков Р5.-С4. и С4.---Р3..

ГЛАВА 5

Физические свойства нуклеотидов: плотность заряда, рК, спектры и таутомеризация

Физические свойства нуклеотидов, которые будут обсуждаться в этой главе, помогают установить некоторые характерные особенности этих молекул. В частности, с их помощью удается понять механизм узнавания основаниями друг друга при спаривании и принципы их взаимодействия с ионами металлов. Оба этих важнейших для биологических систем процесса зависят от распределения плотности заряда, значений рК и таутомерной формы нуклеотида.

5.1. ПЛОТНОСТЬ ЗАРЯДА

Способность оснований к специфическому спариванию путем образования водородных связей обусловливается распределением плотности заряда.

Такое распределение было рассчитано для многих нуклеотидов и их производных; вклад ст- и л-электронов оценивался методами Дель Ре и Хюккеля [72] (рис. 5.1), а общий заряд-методом КВВМО [70, 71, 180].

Из распределения плотности заряда, которое приведено на рис. 5.1, видно, что атомы водорода в аминогруппах аденина, гуанина и цитозина характеризуются примерно одинаковой положительной величиной ст-заряда + 0,22е. Эти атомы обладают слабо выраженными кислотными свойствами и могут выступать в роли доноров при образовании водородной связи: 6- 6+ 6-

N— Н ••• О

Донор Акцептор

Одинаковый положительный зарад, равный +0,19е, несут и водородные атомы при N3 в урациле и при Nt в гуанине, т.е. водородные атомы амидоподобных групп. Этот заряд несколько меньше заряда водородных атомов аминогрупп. С другой стороны, основания могут выступать и как акцепторы при образовании водородных связей. Роль акцепторов играют атомы N,, N3 и N7 в аденине; N3, N7 и 06 в гуанине; 02 и 04 в урациле и тимине, а также N3 и 02 в цитозине. Все эти атомы несут отрицательный заряд, величина которого меняется от

Физические свойства нуклеотидов

123

Рис. 5.1 Распределения плотности заряда в нуклеотидах [72]. Заряд о-электро-нов Дель Ре обозначен прямым шрифтом, а заряд я-электронов Хюккеля-курсивом.

— 0,47е (для атома 02 тимииа) до — 0,65е (для атома N3 цитозина), благодаря чему они являются хорошими акцепторами водородных связей.

Как можно видеть из того же рис. 5.1, влияние общей я-электронной системы гетероцикла распространяется на прилегающие к гетероцик-лам атомы фуранозы-Сг, 04. и С4-. Этим влиянием можно отчасти объяснить укорочение связи Сг—04> по сравнению со связью С4.—04., что обусловлено сопряжением неподеленной пары электронов атома 04. с я-электронной системой гетероцикла. Поскольку атом кислорода 04. несет небольшой отрицательный заряд —0,1 бе, он является слабым акцептором водородной связи. Действительно, образование водородных связей с этим атомом было обнаружено в кристаллических структурах лишь немногих нуклеозидов. Тем не менее при благоприятном стерео-химическом расположении атома 04. относительно Н—О-групп такие связи, по-видимому, образуются (разд. 4.3; рис. 4.11).

Распределение заряда в фосфатной группе указывает, что этерифици-рованные атомы кислорода, несущие заряд — 0,22е, являются плохими акцепторами при образовании водородной связи, а два других кислородных атома, несущие заряд — 0,83е,-хорошими; это находится в соответствии с кристаллографическими данными.

Отрицательно заряженные атомы N и О оснований и атомы кислорода фосфатных групп, способные к образованию водородных связей,

124

Глава 5

Таблица 5.1. Полученные расчетным путем и измеренные экспериментально дипольные моменты для разных оснований1'

Соединение

Теория

величина, D

направление, град

Эксперимент

величина, D2)

Аденин Урацил Гуанин Цитозин

2,9 4,6 7,5 7,6

64 36 -31 102

3,0 3,9

11 Направление вектора дипольного момента отсчитывалось относительно связей N]—С4 в пиримидинах и С*—С5 в пуринах; если в соответствующих структурных формулах атом С2 располагался слева от гликозиднои связи, угол отсчитывался против часовой стрелки [180].

2) Приведены значения для 9-метиладенина и 1,3-диметилурацила.

как правило, могут связывать также ионы разных металлов. Такие комплексы представляют не только биологический, но и стереохимичес