Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

сравнению с природным продуцентом. Отсутствие влияния дозы гена в случае его экспрессии в гетерологичном хозяине может быть обусловлено рядом факторов: структурой промоторных последовательностей, кодон-ным составом, стабильностью иРНК и белка и т. д. (см. 9, часть I).

В ряде случаев для создания высокоэффективных продуцентов были использованы специальные приемы их конструирования. С этой целью соответствующие гены ставятся под контролем сильных промоторов. Учитывая возможное отрицательное влияние сверхсинтеза рестриктаз на жизнеспособность

193

клеток широко применяются индуцибельные промоторы, такие как Рь фага Я, Piacuvs, Ptac, YPhoA- С использованием методов целенаправленного конструирования рекомбинантных плазмид, созданы высокоэффективные продуценты рестриктаз PaeR7 [108], Hha II [143], DpnII [82], EcoR I [53], EcoR V [55], Taq I [34], а также метилаз DpnII 82], EcoRV [55] и RspR I [199].

Продуцент рестриктазы PaeR7 конструировали путем субклонирования тандемно расположенных генов гит под фаговым промотором Рь [108]. Выход рестриктазы после индукции составил 2ХЮ7 ед./г биомассы. Интересно отметить, что белка метилазы было получено в 30 раз меньше по сравнению с эндонуклеазой. Авторы это наблюдение объясняют отсутствием канонической (или производной) SD последовательностью предшествующей метилазному гену [272]. Конструирование продуцента рестриктазы EcoR I проводили путем раздельного клонирования генов rm. Было установлено, что расстояние от промотора Рь до инициаторного кодона гена рестриктазы не имеет существенного влияния на уровень синтеза фермента. Доля рестриктазы после индукции составила 30% от суммарного белка [53]. В случае R EcoRV, наоборот, на уровень синтеза рестриктазы влияло расстояние Рь промотора от инициаторного кодона гена. Выход рестриктазы в оптимальном варианте составил 5% от суммарного клеточного белка. При конструировании продуцента метилазы EcoRV это расстояние не имело значения. Выход метилазы составил 5—10% от суммарного клеточного белка [55]. Тандемно расположенные гены rm Dpn II были поставлены под контроль промотора из фага Т7 [259]. Выход рестриктазы и метилазы повысился в 100 раз по сравнению с исходным штаммом и составил 20% от суммарного клеточного белка [82].

Транскрипция гена метилазы EcoR II, осуществляемая от промотора Рь обеспечивает синтез метилазы в 20—40 раз превышающий ее уровень в исходном штамме [14, 255]. Продуцент рестриктазы Hha II конструировали путем клонирования гена г под контролем промотора Piac uvs [239]. После индукции выход рестриктазы составил 7500 ед/мл культуральной жидкости или 0,3% от суммарного клеточного белка. Промотор Ptac обеспечил эффективный синтез метилазы BspR I. Выход метилазы составил 2—4% от суммарого клеточного белка. Интересно отметить, что после индукции прекращается рост клеток [199]. Причины этого явления неизвестны.

Кропотливая и интересная работа была проведена в случае конструирования продуцента RTaq I [34]. Синтез рестриктазы под контролем промотора Ррьоа позволил получить ее выход, равный 5% от суммарного клеточного белка. Он был одинаков в клетках как r+m~, так и r+m+, т. е. присутствия в клетках сопряженной метилазы Taq I не влияло на содержание эндонуклеазы. Попытки увеличить выход фермента путем при-

194

менения других промотров (Т7, tac) не дали положительного результата. Рассмотрение структуры иРНК. рестриктазы, позволило выявить в кодирующей части инвертированный повтор общей длиной в 31 нуклеотид, потенциально способный образовать шпилечную структуру. Путем генноннженерных манипуляций, часть этой последовательности была модифицирована таким образом, чтобы исключить образование комплементарных связей, что должно было бы реализоваться в виде структуры «шпилька с петлей». В клетках генотипа r+m_ это не дало повышение синтеза рестриктазы. Однако, после включения в рекомбинантную плазмиду гена метилазы было получено резкое увеличение содержания эидоиуклеазы в клетках, которое равнялось 30% от суммарного клеточного белка.

ЛИТЕРАТУРА

1 Александрова С. С., Карамов Э. В. и др. «Биохимия», 1978, 243, 234—236.

2. Альбертсон П. О. В кн.: Разделение клеточных частиц н макромолекул (перевод с англ. под ред. Варшавского Я- М.), М., «Мнр», 1974, 381 с.

3 Белавин П. А., Дедков В. С. и др. «Прикл. бнохим. и микробиол.», 1988, ЧЧШМ, 121—124.

4. Берлин Ю. А., Звонок Н. М. и др. «Биоорган, хим.», 1980, 6, 1182—1195.

5. Буткус В., Казлаускене Р. и др. «Биоорган, хим.», 1985, И, 1572—1573.

6. Воейкова Т. А., Славинская Е. В. и др. «Генетика», 1979, 15, 1746—1755.

7. Генетическая инженерия (методы). Итоги науки и техники, Серия «Молекулярная биология» (под ред. Баева А. А.), ВИНИТИ, М„ 1980, 12, 169—171.

8. Глатман Л. И., Мороз А. Ф. и др. «Докл. Акад. Наук СССР», 1980, 252, 993—995.

9 Ерусланов Б. В., Крамаров В. М. и др. «Биоорган, хим.», 1980, 6, 1361—1369.

10 Захарян Э. Г., Захарян Р. А. и др. «Биологический журнал Армении», 1978, 31, 3—7.

11. Казлаускене Р., Манялене 3. и др. «Биоорган, химия», 1986, 12, 836—838.

12. Косых В. Г., Бурьянов Я. И. и др. «Докл. Акад. наук СССР», 1979, 247, 1269—1271.

13. Косых В. Г., Пунтежис С. А. и др. «Биохимия», 1982, 47, 619—624.

14. Косых В. Г., Солонин А. С. и др. «Докл. Акад. наук СССР», 1980, 252, 995—998.

15. Крамаров В. М. Автореф. дис. канд. биол. наук, Москва, 1981, 20 с.

16. Крылов В. Н., Карапетян А. Т. «Генетика», 1977, 13, 1079—1088.

17. Кузьмин Н. П., Фодор И. и др. «Докл. Акад. Наук СССР», 1977, 236, 477—480.

18. Никольская И. И., Карпец Л. 3. и др. «Молек. генетика, микробиол. и вирусол.», 1983, 12, 5—10.

19. Никольская-Санович И. И. Диссертация д-ра биол. наук, М., 1981, 459 с.

20. Орехов А. В., Ребентиш Б. А. и др. «Докл. Акад. Наук СССР», 1982, 263, 217—220.

21. Повиленис П. И., Лубис А. А. и др. «Генетика», 1989, 25, 753—755.

22. Повиленис П. И., Лубис А. А. и др. «Генетика», 1988, 24, 210—215.

23. Соколов Н. Н., Вотрин И. И. и др. «Биохимия», 1978, 43, 865—871.

24. Соловьева Н. #., Раутенштейн Я. И. «Микробиология», 1978, 47, 956—958.

25. Тедиашвили М. И., Никольская И. И. и др. «ЖМЭИ», 1979, 5, 78—83.

195

26. Тедиашвили М. И., Упорова Т. М. и др. «Бюлл. экспер. биол. медицины», 1980, 90, 324—325.

27. Упорова Т. М-, Хилько С. Н. и др. «Вопр. мед. химии», 1982, 28, 78—81.

28. Холмина Г. В., РебеНтиш Б. А. и др. «Докл. Акад. Наук СССР», 1980, 253, 495—497.

29. Янулайтис А. А., Вайткявичюс Д. П. «Биотехнология», 1985, 39—51.

30 Янулайтис А. А., Стакенас П. С. и др. «Мол. биол.», 1984, 18, 115—129.

31 Arrand J. R-, Myers P. A. et al. «J. Mol. Biol.», 1978, 118, 127—135.

32 Baksi K-, Rogerson D. L. et al. «Bioehemistry», 1978, 17, 4136—4139.

33. Baksi К-, Rushizky G. W. «Anal. Biochem.», 1979, 99, 207—212.

34. Barany F. «Gene», 1987, 56, 13—27.

35. Barany F. «Gene», 1988, 65, 167—177.

36. Barsomian L, Camp R. et al. In: «Workshop on biological DNA modification*, New England Biolabs, Gloucester, MA, 1988, p. 1.

37. Barsomian J., Card C.

страница 69
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.09.2019)