Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

ого результата. Он был достигнут только путем поэтапного клонирования генов метилазы и рестриктазы на совместимых плазмидах. Вынужденность использования именно такого подхода авторы, на основе полученных ими данных, объясняют тем, что в случае клонирования Pst I фрагмента, содержащего гены rm Dde I, уровень синтеза метилазы был недостаточным для защиты ДНК от действия рестриктазы. Необходимый уровень экспрессии был достигнут только в случае раздельного клонирования гена метилазы в составе фрагмента величиной 1,6 кб, вырезанного из донорной ДНК рестриктазами Hind III и Cla I, что привело к частичному удалению гена рестриктазы вместе с промотором и части m гена, кодирующей 33 С-концевых аминокислот. В случае Hind III фрагмента величиной 3 кб, содержащего интактный ген метилазы, уровень его экспрессии, как и в случае Pst I фрагмента, по неустановленным причинам был недостаточным для защиты внутриклеточной ДНК от рестриктазы. Этот пример наглядно демонстрирует, как влияние способа вырезания, так и на необходимость определенного уровня экспрессии гена метилазы для получения положительного результата в отношении клонирования рестриктазного гена.

Завершая обсуждение методов клонирования следует обратить внимание на один необычный вариант, имевший место в случае RDpn I [160]. В этом случае можно говорить о генной инженерии in vivo, реализовавшейся благодаря наличию гомологии между последовательностями фланкирующими гены rm Dpn II и г Dpn I. При трансформации Streptococcus pneumoniae— продуцента RDpn I рекомбинантной плазмидой, несущей гены rmDpn II in vivo, произошла рекомбинация с хромосомой и в результате в плазмиду перешли гены dpnC и dpnD (кассета генов Dpnl), которые заменили таким образом гены rm Dpn II (dpnM, dpnA, dpnB).

5.2. Факторы, влияющие на успешное клонирование генов rm

5,2.1. Скоординированная экспрессия

Как видно из данных, представленных в табл. 24, получено довольно большое число клонов, содержащих только ген метилазы. Объясняется это тем, что как известно система RM состоит из двух ферментов — рестриктазы и метилазы. Метилаза защищает клеточную ДНК от воздействия сопряженной рестриктазы. Поэтому в общем случае отдельно можно клонировать только ген метилазы, а в случае рестриктазы необходимо клонировать оба гена одновременно или осуществлять перенос гена рестриктазы в клетки, имеющие соответствующий модифицирующий фермент. Обычная практика осуществления экспериментов направлена на реализацию именно первого подхода. Следует отметить, что во всех исследованных случаях наб-

188

людалось тесное сцепление генов рестрикции-модификации. Однако, на основе имеющихся данных, было бы преждевременно утверждать, что это является общим правилом, так как используемые методы клонирования позволяют надеяться получить положительный результат только в случае удовлетворения этого условия.

Представляется, что совместное клонирование генов rm является условием необходимым, но недостаточным для положительного исхода эксперимента. После их попадания в реципи-ентную клетку встает вопрос как об экспрессии этих генов вообще, так и (в случае удовлетворения этого условия) о первоочередном проявлении защитной функции метилазы в отношении ДНК до воздействия на нее рестриктазы. Предположительно последнее реализуется путем опережающей экспрессии гена метилазы. Возможные механизмы, обеспечивающие выполнение этого условия рассмотрены в главе 9 (часть I). Формально, в случае одновременной экспрессии обоих генов rm, возможен и другой путь предотвращения гибели клетки. Для этого необходимо, чтобы метилаза опередила действие рестриктазы на субстрат. В качестве одного из возможных факторов играющего роль в опережающем проявлении активности метилазы приводятся данные о том, что рестриктазы в отличие от первого фермента являются гомомультимерными белками. Предполагается, что время необходимое для сборки субъединиц в активную форму белка в некоторых случаях может оказаться достаточным для модификации ДНК ферментом, который не обладает четвертичной структурой и сразу после его синтеза может взаимодействовать с субстратом [286].

Неудача клонирования может быть связана и с отсутствием экспрессии клонированных генов rm. Гены рестрикции— модификации выявлены в самых различных таксонах (см. разд. 2, часть I). Клонирование их осуществляется практически исключительно в кишечную палочку. Имеющиеся сведения свидетельствуют, что в Е. coli удается клонировать гены rm из представителей таксонов генетически довольно отдаленных от кишечной палочки. Однако, вопрос о том все ли эти гены экспрессируются с собственных промоторов пока до конца де исследован. Методическое решение проблемы экспрессии видится в реализации нескольких подходов. В первую очередь следует обратить внимание на то, что большое число рестриктаз выявлено в штаммах, относящихся к семейству Enterobacteria-сеа (см. гл. 2, часть I) в которое входит и Е. coli. Учитывая большое генетическое родство между представителями энтеро-бактерий, следует предположить и меньшую вероятность получения отрицательных результатов по клонированию в кишечную палочку за счет барьера гетерологической экспрессии.

В общем случае при выдвижении предположения о том, что возможной причиной неудачи является обсуждаемый барьер

14—5933 6

189

или нескоординированная экспрессия генов rm, решение проблемы видится в клонировании генов метилазы и рестриктазы (вместе или поэтапно) в векторе экспрессии, содержащем перед местом вставки клонируемых фрагментов донорной ДНК про-моторные участки функционирующие в кишечной палочке.

При рассмотрении литературных данных обращает на себя внимание тот факт, что в некоторых случаях поставленная цель была достигнута путем получения с первого взгляда неоправданно больших клонотек [22, 124, 139]. Авторами публикаций этот факт никак не обсуждается. Исключение составляет pa6oJ та, посвященная клонированию генов rm Ben I i[22], где получение большой клонотеки обосновывается предположением1 о необходимости неслучайного их вырезания из хромосомы.

Первые опыты по клонированию рестриктазы Ben I в Е. coli не дали положительного результата. В ходе их выполнения удалось выделить только ген метилазы Ben I [131]. В этих экспериментах число трансформантов, учитывая величину клонируемых фрагментов и допуская тесное сцепление генов rm Ben I, было достаточным для клонирования последних в Е. coli. Отсутствие клонов, несущих оба гена, могло быть обусловлено рядом причин, в том числе и существованием определенных ограничений к способу вырезания генов rm Ben I из хромосомы, т. е. предполагалось, что совместное клонирование, экс-прессирующихся в Е. coli генов рестриктазы и метилазы Ben I, Не вызывающее гибели реципиентных клеток, может реализоваться только в случае их вырезания из хромосомы определенным образом. Такое событие, очевидно, должно происходить" реже, чем случайное вырезание исследуемых генов в любом окружении. Это предположение поддавалось проверке при увеличении числа трансформантов в клонотеке. В случае В. cent-rosporus была полу

страница 67
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(09.12.2019)