Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

х методов [62, 67, 89, 90, 104, 161, 164, 169, 281].

Следует отметить, что метод секвенирования для определения места расщепления используется не только в упомянутом варианте (сравнение подвижности исследуемого рестрикта с фрагментами «структурной лесенки»). Он наряду с методом фингерпринтирования, применяется для определения структуры концевых последовательностей фрагментов, генерируемых исследуемыми рестриктазами [84, 85, 90, 167, 185, 281[.

Использование синтетических олигонуклеотидов. Другой методический подход, применяемый для определения места расщепления рестриктаз, стал доступен благодаря созданию эффективных методов химического синтеза олигодезоксрибонуклеотидов. Основной прогресс в этой области был связан с разработкой более совершенного фосфотриэфирно-го [256] и фосфоамидитного методов [175] и перехода от синтеза в растворе на синтез с использованием полимерных носителей [71, 175].

Процедура определения места расщепления с использованием синтетического субстрата выглядит очень просто. Для этого олигонуклеотид, содержащий сайт исследуемой рестриктазы, метится по 5'-концу при помощи Т4-полинуклеотидкиназы и [X—32Р]АТФ, и обрабатывается исследуемым ферментом. Затем реакционную смесь анализируют при помощи ионообменной хроматографии в тонком слое ДЭАЭ-целлюлозы. В качестве маркеров параллельно разделяют продукты лимитированного гидролиза этого же меченого олигонуклеотида. Место расщепления сайта определяется путем сравнения подвижности продуктов рестрикционной реакции и лимитированного гидролиза субстрата. Очевидно, что применение этого метода возможно лишь в тех случаях, когда узнаваемая последовательность рестриктазы уже определена другими методами.

Требования, предъявляемые к длине субстрата, вероятно, могут значительно варьировать для различных рестриктаз. Для большинства ферментов достаточно синтезировать самокомплементарный олигонуклеотид, в котором узнаваемый сайт фланкирован одним-двумя нуклеотидными парами. Субстраты такой длины, как правило, хорошо расщепляются большинством рестриктаз. Вместе с тем имеются также сведения, что рестриктаза Hind III не расщепляет олигонуклеотид в котором узнаваемый сайт с обеих сторон фланкирован шестизвенными последовательностями [4].

179

В принципе, синтетические субстраты могут применяться и в случае вырожденных узнаваемых последовательностей, а также в тех случаях, когда расщепление субстрата происходит за пределами узнаваемого участка. В первом случае место расщепления можно определить на одной из узнаваемых последовательностей, предполагая, что все остальные будут расщепляться одинаково, или можно к синтезу привлечь все варианты вырожденного субстрата. Примечательно, что для этого нет необходимости проводить много синтезов; для этого существует стратегия, позволяющая получить любой набор разных вариантов частично гомологичных последовательностей одним приемом. В тех случаях, когда имеется предварительная информация, что расщепление происходит за пределами узнаваемого участка, необходимо синтезировать олигонуклеотид с более длинными фланкирующими участками. Так как известны рестриктазы, расщепляющие субстрат на расстоянии 9, 13 и даже 16-ти нуклеотидных пар от узнаваемого участка, то длина требуемой последовательности приближается к 20—25 нуклеотид-ным парам. Если еще учесть, что ориентация расщепления неизвестна, то величина олигонуклеотидного субстрата удваивается. Таким образом становится ясным, что даже при наличии возможностей синтезировать олигонуклеотид такой длины может оказаться целесообразным обратиться к другим методам.

Несмотря на свою привлекательность, метод, основанный на использование синтетических субстратов для определения места расщепления рестриктаз используется относительно редко. Можно привести не так уж много примеров его применения [5, 11]. Вероятно, одной из причин являются ограниченные возможности быстрого синтеза требуемых олигонуклеотидов в лабораториях, занимающихся выделением рестриктаз. Вслед-ствии этого большинство исследователей традиционно применяют какой либо другой метод, имеющийся в арсенале лаборатории.

В заключение можно сказать, что современные методы анализа нуклеиновых кислот позволяют определить место расщепления субстрата для рестриктазы любой специфичности. Выбор стратегии и метода определения зависит от особенностей узнаваемого участка и методов, которыми владеет экспериментатор.

5. КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНОВ РЕСТРИКЦИИ-МОДИФИКАЦИИ

В настоящее время из огромного числа известных рестриктаз и метилаз, клонированы гены всего лишь 48 систем рестрикции—модификации и 26 метилаз, относящихся к системам RM (табл. 23 и 24). Развитие этого направления исследований условно можно разделить на два этапа. На первом этапе в течение довольно продолжительного времени (1978 г.)

180

Таблица 23

Клонированные системы рестрикции-модификации II типа

Система Уанаваемая Вектор Шт амм—реципиент , + ° + §^ H « Продуцент Лите-

RM последователь- рестрикта- ратура

ность 1 Асе I GT(A/C)- ? ? ? Acinetobac- [361

(T/G) ter calcoace-

ticus [190J

2 Afl II CTTAAG pJRD 184 E. coli6> ? Anabaena

Ase I flosaquae [190]

3 ATTAAT pUC 19 E. coli ? Aquaspiril-

Ava I lum serpens 1190J

4 CPyCGPuG pUC 19 E. coli ? Anabaena

variabilis [190}

5 Ava II GG(A/T>- pUC 19 E. coli ? Anabaena

CC variabilis [601

6 BamH I GGATCC ? E. coli D Bacillus amylolique-

Ban I faciens [190J

7 GGPyPuCC ? E. coli ? Bacillus aneurinoly- 8 Ben I ticus [22,

CC(C/G)- pBR 327 E. coli RR1 С Bacillus

Bsp6 I GG D ceratroisporus

9 GCNGC M-pACYC E. coli RR1 Bacillus [2001

184 species

RM-PIC E. coli RR1

10 19H

BsuR I GGCC pBR 322 E. coli RR1 D Bacillus [147,

II Cfr I subtilis R 148]

PyGGCCPu pACYC 177 E. coli RR1 С Citrobacter [2001

Cfr9 I С freundii

12 CCCGGG pACYC 177 E. coli RR1 Citrobacter [200]

13 CfrlOI freundii

PuCCGGPy pBR 327 E. coli RR1 С Citrobacter [200]

14 freundii

Dde I CTNAG M-pBR 322 R-pACYC 184 E. coli RR1 E. coli ER 1467 D Desulfovib-rio desulfu-ricans [124. 269]

15 Dpn II GATC pLS 101 Streptococcus pneumoniae 762 E. coli В Streptococcus pneumoniae (Diplo-coccus pneumoniae) [1601

16 EagI CGGCCG ? E. coli В Enterobacter [268]

17 agglomerans EcoR I GAATTC pCS 101 E. coli А Escherichia [421

18 HB101 coli

EcoR II CC(A/T)GG GG RSF E. coli А Escherichia [121

2124 C600 coli

Г9 EcoR

страница 64
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.09.2019)