Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

>173-

следуемым ферментом, при помощи полинуклеотидкиназы фага Т4 в присутствии [X—32Р] АТФ с последующим анализом их структуры. С этой целью меченые фрагменты обрабатывали ферментами в условиях, обеспечивающих их гидролиз до моно-нуклеотидов (фосфодиэстеразой змеиного яда) или позволяющих получать набор ди-, три-, тетра- и т. д. олигонуклеотидов (обработка панкреатической ДНК-азой). Продукты частичного гидролиза выделяли и осуществляли анализ первичной структуры каждого индивидуального меченого олигонуклеотида. Анализ З'-концевого динуклеозидмонофосфата, полученного гидролизом равномерно меченых ДНК-рестриктов микрококковой нуклеазой, позволил установить З'-концевую структуру Hind II фрагментов. На основе совокупности полученных данных оказалось возможным определить последовательность нуклеотидов, узнаваемую исследуемым ферментом, и также способ расщепления субстрата. Аналогично была определена специфичность рестриктазы EcoR I [265], Hind III [195], EcoR II [45] и ряда других эндонуклеаз. Рассмотренные выше аналитические приемы отличались громоздкостью и трудоемкостью. В настоящее время они представляют только исторический интерес.

Со времени открытия первых представителей рестриктаз II типа, как и в случае исследования сайтовой специфичности, методы определения места расщепления постоянно совершенствовались. Происходило это в основном благодаря бурному развитию методов анализа первичной структуры олигонуклеотидов и полинуклеотидов, а также появлению возможности быстро синтезировать олигонуклеотиды любой длины и последовательности. Все новейшие достижения в области синтеза и анализа нуклеиновых кислот быстро адаптировались для определения специфичности рестриктаз.

Метод фингерпринтирования. Разработке метода «отпечатков пальцев» («fingerprint») известного также под названием метода «блуждающего пятна» («wondering spot»), способствовало появление и накопление данных о поведении коротких олигонуклеотидов в различных условиях тонкослойной хроматографии и электрофореза, а также определение закономерностей подвижности олигонуклеотидов в зависимости от состава оснований. Суть его заключается в последовательном двухмерном разделении продуктов статистического экзонуклеазного гидролиза исследуемого олигонуклеотида, содержащего концевую изотопную метку, при помощи сначала электрофореза, потом анионообменной хроматографии в тонком слое ДЭАЭ-цел-люлозы. Разделение по первому направлению проводится в кислом буфере, что позволяет проявиться нуклеотидному составу каждого из продуктов статистического гидролиза. Разделение по второму направлению происходит только в зависимости от длины продуктов гидролиза. После авторадиографии, по относительному расположению радиоактивных пятен и с учетом

174

правил интерпретации сдвигов продуктов гидролиза относительно более короткого сегмента в зависимости от природы добавленного звена, разработанных Ту и By [278], определяется первичная структура исследуемого олигонуклеотида. Природа первого звена — 5'-мононуклеотида определяется независимым методом. Применение рассмотренного способа определения специфичности рестриктаз основывается на том, что большинство рестриктаз расщепляют палиндромный сайт симметрично и в пределах узнаваемого участка. Таким образом после расщепления все ДНК-фрагменты имеют гомологичные концевые участки. Протяженность этих участков в 3'- и 5'-направлениях будет за-висить от размеров узнаваемого участка и от способа его расщепления. Например, шестизвенный Hind III сайт (5'A*AGCTT) после расщепления образует пятизвенную 5'-концевую гомологичную последовательность, а всем З'-концевым последовательностям единственным гомологичным звеном будет адениновый нуклеотид, т. е. во втором случае размеры общего участка будут минимальными. В случае рестриктазы Kpn I, узнающей и расщепляющей 5'GGTAC4C последовательность, будет наблюдаться противоположная картина, то есть образуется пятизвенный З'-концевой гомологичный участок и минимальный 5'-концевой. Величина гомологичной части при использовании метода фин-герпринтирования имеет важное значение, так как пометить можно любой из концов ДНК-фрагментов. Однако, введение 5'-концевой метки при помощи Т4-полинуклеотидкиназы в рестрикционные фрагменты Kpn I (5'GGTAC+C) или, в 3' конец фрагментов полученых под действием Hind III (5'A^AGCTT) при помощи обычно с этой целью используемой терминальной дез-оксинуклеотидилтрансферазы [135], представляется нецелесообразным, так как фингерпринт не дает нужной информации. В общем случае, когда отсутствует информация о структуре липких концов, что обычно имеет место при исследовании нового фермента, выбор того или иного способа введения метки несет определенную степень риска. С другой стороны существует ряд обстоятельств, позволяющих свести такой риск до минимума. Во-первых, количество рестриктаз образующих З'-высту-пающие фрагменты значительно меньше тех, которые образуют 5'-выступающие или спареные концы, что указывает на предпочтительное использование 5'-киназной метки. Во-вторых, на предварительном этапе работы иногда можно получить информацию о предполагаемом месте расщепления. Для этого перед фингерпринтированием можно проанализировать концевой мо-нонуклеотид, акцептирующий радиоактивную метку. Косвенным указанием на ожидаемое место расщепления также может служить специфичность известного прототипа.

Благодаря простоте исполнения и информативности метод фингерпринтирования широко применяется для анализа специфичности рестриктаз. В качестве примера можно перечислить

175

целый ряд рестриктаз, специфичность которых была определена этим методом: Alu I [219] BamH I [221], Mbo I [101], Sau3A I [264], Pvu II [63] и др. [46, 100, 265, 277].

В тех случаях, когда продукты рестриктазной реакции имеют полностью спаренные концы, анализ 5'-концевой последовательности дает информацию лишь о структуре половины сайта. В отсутствии сведений об узнаваемом участке, полученных независимыми методами (например, косвенными), для большей достоверности анализ З'-коицов является необходимым. Чаще всего для этой цели используется метод анализа ближайших соседей. В таких случаях применение ДНК полимеразы Т4, благодаря присущих ей полимеразной и 3'-*-5' экзонуклеазной активностей, позволяет в присутствии меченных нуклеозидтрифос-фатов ввести 32Р-меченый З'-концевой нуклеотид. После гидролиза рестриктов соответствующими фосфодиэстеразами и анализа продуктов реакции определяется ближайший сосед включенного меченого предшественника [99, 166]. В результате такого анализа устанавливается структура З'-концевого дину-клеотида рестрикционного фрагмента. Обсуждаемый методический подход нашел применение в экспериментах по определению субстратной специфичности рестриктаз Xma I [92] и Hind III [195].

Метод матричного копирования ДНК при помощи полимеразы иногда используется и для анализа рестрикционных фрагментов с б'-выступающими концами. С этой целью проводится серия опытов, где З'-конец фрагмента достраивается полимера-зой в присутствии одного меченого и остальных немечен

страница 62
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.09.2019)