Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

ентичной специфичности этих ферментов. Иногда применение этого метода сводится к сравнению полученной рестриктограммы с таковыми, представленными в каталожных изданиях [189]. Очевидно, что настоящий метод пригоден только для характеристики аналогов уже известных рестриктаз (изошизомеров). Следует однако отметить, что такая оговорка недействительна в случае впервые обнаруженных рестриктаз с палиндромной сайтовой специфичностью, так как все варианты предполагаемого электрофоретического распределения фрагментов в этом случае рассчитаны на ЭВМ и в графическом виде представлены в справочной литературе [190].

Параллельно и в дополнение к методу визуального сравнения широко используется метод картирования ДНК. Метод, широко используемый в молекулярной генетике, нашел свое применение в исследованиях специфичности рестриктаз благодаря определению первичной структуры ряда ДНК-стандартов — небольших фагов и плазмид [39, 212, 231, 232, 266]. Визуальное сравнение нуклеотидных последовательностей в картированных районах в большинстве случаев позволяет обнаружить гомологические последовательности и тем самым определить узнаваемые участки. Если на этапе сравнения экспериментально полученной рестриктограммы с каталожными или расчетными иллюстрациями, сделано предположение о сайтовой специфичности исследуемого фермента, то для его подтверждения может быть также использован метод картирования. В этом случае предполагаемые координаты расщепления субстрата исследуемой рестриктазой бывают известны и поэтому величины и число фрагментов совместного расщепления с какой-либо известной рестриктазой можно получить расчетным путем. Совпадение расчетных и экспериментальных данных будет указывать на правильность предварительного вывода.

Другой важной вехой в области исследования специфично-

12*

171

сти рестриктаз были разработанные Фуксом с соавт. [96, 97] таблицы частоты встречаемости палиндромных тетрануклеотид-ных-гексануклеотидных последовательностей в ДНК некоторых вирусов, фагов и плазмид. Для этих стандартных ДНК было определено число каждого из палиндромных сайтов а также расстояния между ними. Таким образом, экспериментально определяется только частота расщепления исследуемым ферментом нескольких стандартных ДНК и, в случае необходимости, их величины. В дальнейшем эти данные сравниваются с таковыми представленными в таблицах [96, 97]. В большинстве случаев этих данных бывает достаточно, чтобы предсказать сай-товую специфичность исследуемого фермента.

В настоящее время разработаны программы для микро-ЭВМ, позволяющие быстро картировать любые нуклеотидные последовательности в различных ДНК-субстратах. Для этой цели используются как централизованные банки ДНК, так и собственные нуклеотидные последовательности. Такие программы позволяют не только картировать определенные точки, но и определить в картированных районах гомологические участки, что оказывается крайне полезным в случае более сложных вариантов сайтовой специфичности.

Резюмируя накопленный опыт можно рекомендовать следующую тактику применения косвенных методов (они даются в порядке методического усложнения) для предсказания структуры участка узнаваемого исследуемым ферментом: 1) визуальное сравнение электрофореграмм продуктов расщепления ДНК фага % исследуемым ферментом с аналогичными литературными данными относительно известных рестриктаз; 2) определение частоты расщепления и величин генерируемых фрагментов нескольких стандартных субстратов (ДНК pBR322, ФХ174, fd, SV40) с установленной первичной структурой [39, 212, 232, 266] и сравнение полученных данных с табличными [96, 97]. После того, как была установлена первичная структура ДНК фага X [231], большим подспорьем в таких экспериментах явились аналогичные таблицы, составленные для этого субстрата А. Мироновым (ВНИИ Генетика); 3) картирование местоположения сайтов расщепления на вышеуказанных ДНК и поиск общих цоследовательностей в их окружении.

Очевидно, что для предсказания специфичности конкретного исследуемого фермента зачастую нет необходимости в использовании все вышеперечисленных приемов. Иногда для достижения поставленной цели оказывается достаточным применить один или два из них.

Для подтверждения предполагаемой субстратной специфичности предлагается применять: 1) совместную обработку субстрата исследуемым ферментом и предполагаемым прототипом (в случае доступности), 2) определение числа и величин фрагментов, образующихся в результате действия исследуемого фер-

172

мента на стандартные ДНК и сравнение полученных данных с рассчитанными на основе известной последовательности нуклеотидов этих ДНК и структуры предполагаемого сайта узнавания, 3) два варианта метода картирования — точное и относительное.

Относительное картирование заключается в обработке субстратов с известной первичной структурой исследуемым ферментом в смеси с некоторыми известными рестриктазами и сравнение величин полученных фрагментов с расчетными. Относительное картирование с методической точки зрения ничем не отличается от точного. И в этом и в другом случае проводится обработка субстрата смесью исследуемого фермента с известными (попарно) и определение величин получаемых фрагментов. Путем логических рассуждений с учетом координат участков, узнаваемых использованными в опытах рестриктазами с известной субстратной специфичностью, можно определить местоположение точек, расщепляемых исследуемым ферментом. Однако, в тех случаях, когда проверяется субстратная специфичность новой рестриктазы, предсказанная на основе других опытов, в этом нет необходимости, так как координаты ее предполагаемого участка узнавания относительно сайтов расщепления известных рестриктаз могут быть рассчитаны на основе данных о первичной структуре используемых субстратов. Сравнение расчетных данных с экспериментальными сразу без дополнительных рассуждений дает ответ, является ли предполагаемая последовательность нуклеотидов субстратом исследуемого фермента. Кроме того, в этом случае допустима обработка субстрата не всеми комбинациями: известные рестриктазы — исследуемая, необходимыми для точной локализации точек расщепления последней. Это тоже снижает трудоемкость экспериментов. Учитывая тот факт, что таким способом проверяется относительное расположение многих сайтов узнавания, надежность определения субстратной специфичности исследуемой рестриктазы методом относительного картирования является высокой.

4.2. Методы определения места расщепления субстрата

С применением косвенных методов удается определить только первичную структуру узнаваемой последовательности. Для того чтобы установить место расщепления фосфодиэфирной связи, необходимо использовать прямые методы структурного анализа ДНК. Очевидно, что задача определения места разрыва, когда известны структурные особенности узнаваемой последовательности, значительно упрощается.

Для определения субстратной специфичности первой открытой рестриктазы II типа — Hind II [144] было использовано введение метки в 5'-концы фрагментов ДНК, генерируемых ис-

13-5933

страница 61
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(14.11.2019)