. Сказанное подтверждают данные о достижении при хроматографии на ФРП 10-ти кратной [74, 152], 40-кратной [107, 184, 228], 50-ти кратной [154], 100-кратной [29] и даже 226-ти кратной [58] очистки. Потери целевых ферментов во всех случаях не превышали половины, а в некоторых составили менее 20% [184, 283]. Для применения ДЭАЭц, включаемой в схемы очистки гомогенных рестриктаз в основном на предпоследних стадиях, характерна степень очистки, равная 1,3—6-кратной [13, 58, 118, 138, 302]. Только в нескольких случаях достигаемая степень очистки была близкой к 10-ти кратной [72, 177], а в случае рестриктазы Ali I равнялась 23-кратной [299]. За исключением последнего случая, высокоэффективная очистка (более чем десятикратная) сопровождалась большими (60—90%) потерями целевых ферментов [72, 177]. Аналогичные, как и в случае ДЭАЭц, показатели в отношении достигаемой степени очистки характерны и для применения (в основном на предпоследних стадиях очистки) хроматографии на ГАП [72, 107, 118,

168

152, 177, 184, 228]. Однако, потери целевых ферментов в последнем случае в среднем были меньшими.

Высокую эффективность ФР II скорее всего следует отнести за счет возможного участия аффинных взаимодействий рестриктаз с этим сорбентом. В этом отношении больший интерес представляют данные, полученные с применением другого аффинного катионита — ГС. Ее использование на первых хроматографических стадиях выделения, последовавших после удаления нуклеиновых кислот, дало 20-ти кратную [118, 302], 75-ти кратную [299] и 100-кратную [33] очистку. Выходы целевых ферментов во всех цитированных случаях превышали 80%. Только в случае выделения рестриктазы SalG I очистка и выход равнялись соответственно 3-кратной и 30% [177]. Однако в этом случае хроматография на ГС осуществлялась на предпоследней стадии и дала препарат, в котором больше чем половина белка приходилась на рестриктазу SalG I. Поэтому эти данные нельзя рассматривать, как свидетельствующие о низкой эффективности ГС в случае очистки указанного фермента.

В случае выделения гомогенного препарата рестриктазы Ben I ГС была использована для хроматографического фракционирования грубого экстракта продуцента этого фермента. В результате было достигнуто 150-ти кратное увеличение удельной активности целевого фермента, выход которого составил более 50% [196]. ГС в опытах по выделению функционально' очищенных препаратов рестриктаз применяется не так уж и часто. Приведенные выше данные, иллюстрирующие высокую эффективность этого сорбента в отношении очистки рестриктаз, убеждают о перспективности ГС для получения функционально-очищенных препаратов специфических эндонуклеаз.

Оригинальностью подхода к получению гомогенных препаратов рестриктаз выделяется работа, выполненная Еруслано-вым Б. с соавт. [9]. Авторами этой работы были разработаны два метода выделения гомогенной EcoR I. Первый из них явился традиционным в отношении использованных средств — был основан на применении двухстадийной схемы очистки (хроматография на ФРП и гельфильтрация на сефадексе Г—150). Фракции, полученные после гельфильтрации, содержащие целевой фермент, подвергали электрофоретическому анализу в денатурирующих условиях и отбирали те из них, которые содержали только один белок. Отбор небольшой части фракций, удовлетворяющих установленному требованию (гомогенность белка), привел к низкому выходу на данной стадии, который равнялся 20%. Однако, в целом выход гомогенного препарата составил 5,1 мг/г биомассы, который ненамного уступал этому показателю, наблюдаемому в случае использования для выделения гомогенной EcoR I многостадийных схем [184, 228]. Это, учитывая неизбежные потери целевого фермента на каждом этапе реализации последних схем, вполне объяс-

12—5933

6

169

нимо. Выбранные Еруслановым Б. с соавт. [9] путь — идти на большие потери сразу, уже на второй стадии очистки в данном случае вполне себя оправдал и позволил отказаться от проведения дополнительных этапов выделения. Другой подход к получению гомогенного препарата, апробированный цитированными выше авторами, был основан на использовании иммуно-сорбента, содержащего иммобилизованные антитела к EcoR I. В аналитических экспериментах были продемонстрированы большие потенциальные возможности этого метода. Расчеты показывают, что в случае его реализации в препаративном варианте из 1 кг биомассы удалось бы получить около 27 мг рестриктазы в гомогенном состоянии. Использование иммуносор-бентов в препаративной биохимии рестриктаз пока представляет только теоретический интерес. Однако со временем могут возникнуть задачи, для решения которых привлечение этого подхода может оказаться полезным.

4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУБСТРАТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ РЕСТРИКТАЗ

Основной характеристикой специфичности эндонуклеаз является узнаваемая последовательность нуклеотидов. Ее определение позволяет каталогизировать новый фермент по отношению к известным, т. е. установить является ли он изошизоме-ром или прототипом. Наличие этих сведений является отправной точкой для дальнейшей характеристики исследуемого фермента (место расщепления субстрата, специфичность по отношению к модификациям субстрата и т. д.) и служит одной из предпосылок для принятия решения об его перспективности для использования в качестве аналитического реагента.

4.1. Косвенные методы определения узнаваемого участка

При определении субстратной специфичности первых обнаруженных рестриктаз в начале в основном применялись только прямые биохимические методы анализа. Задача определения специфичности и места расщепления сайта тогда практически сводилась в один эксперимент — определение первичной структуры концевых участков по месту расщепления субстрата (49, 116, 144, 195]. С момента открытия первых рестриктаз методы определения специфичности перетерпели большую эволюцию, характерной чертой которой явилось всевозможное использование более быстрых и более простых как прямых так и косвенных методов. Привлечение косвенных методов, в основном коснулось только изучения сайтовой специфичности рестриктаз; задача определения места расщепления субстрата и по сей день решается прямыми биохимическими методами.

170

В развитии косвенных методов определения сайтовой специфичности основную роль сыграло: (1) появление большого числа охарактеризованных рестриктаз и накопление данных об основных типах построения узнаваемых участков, (2) установление первичной структуры ДНК ряда небольших вирусов и плазмид, (3) использование вычислительной техники.

Стремительный рост числа новых рестриктаз и определение основных типов их субстратной специфичности [183] привел к появлению самого простого из косвенных методов, так называемого метода визуального сравнения, сущность которого заключается в сопоставлении результатов расщепления одного и того же субстрата известной и исследуемой рестриктазами. Так как при действии какой-либо рестриктазы на индивидуальную ДНК образуется характерный набор рестриктов, то в случае совпадения картин их электрофоретического разделения (ре-стриктограмм), делается вывод об ид