Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

сит необходимость достижения физической чистоты белка, что a priori является более сложной задачей, чем очистка от функциональных нежелательных примесей. Указанные факторы находят выражение в схемах выделения гомогенных рестриктаз как в отношении способов осуществления отдельных стадий, так и их количества и качественного набора.

В препаративных опытах для разрушения клеток наряду с ультразвуком [29, 80, 106, 127, 152, 234, 299] относительно часто используются механические экструзионные дезинтеграторы [13, 74, 138, 163, 184, 254], позволяющие обрабатывать большие объемы биомассы. Получаемые объемы гомогената в большинстве случаев не исключают возможности проведения стадии центрифугирования в режимах, аналогичных таковым в случае аналитических опытов. Только в случае выделения Bstl503, проводившегося из 70 кг биомассы В. stereother mophilus 1503, с этой целью было использовано проточное центрифугирование [74].

Увеличение объемов рабочих растворов находит отражение и в методических приемах, используемых на стадии удаления нуклеиновых кислот. Гельфильтрация, довольно часто применяемая в опытах по получению функционально очищенных препаратов рестриктаз, в масштабированных схемах очистки практически не встречается. Единственное исключение в этом плане составляет первоначальная схема выделения гомогенной рестриктазы Bsp I [152]. Однако, в ходе усовершенствования схемы очистки этого фермента, этот прием был заменен на высажде-ние нуклеиновых кислот полиэтиленимином [283]. Отказ от применения гельфильтрация в обсуждаемых опытах следует отнести не только за счет малопривлекательности масштабирования этой процедуры, но и за счет низкой ее эффективности на первой стадии в отношении очистки целевых ферментов.

В большинстве случаев выделения гомогенных препаратов рестриктаз для удаления нуклеиновых кислот используется их высаждение при помощи СС или ПЭИ [13, 72, 106, 107, 127, 138, 184, 299, 234], что, учитывая простоту масштабируемости этого приема, является вполне понятным. Имеются примеры использования для разделения нуклеиновых кислот и целевых ферментов на первой стадии препаративных опытов сорбентов, в том числе ФРП [29, 34, 80, 254], гепаринсефарозы [196] голубой сефарозы [33] и ДЭАЭц [74]. В цитированных случаях только в случае выделения Bgl I [163] грубые экстракты перед нанесением на сорбенты подвергались высаливанию.

Высаливание белков нашло применение во многих схемах выделения гомогенных препаратов рестриктаз и за несколькими исключениями [34, 72, 80, 127, 138] проводилось в подобран-

166

ном ступенчатом режиме [74, 140, 152, 184, 299, 302], позволяющем добиться наряду с концентрированием исследуемых препаратов и их освобождением от ПЭИ [13, 127, 140] или СС [72, 106, 107, 184, 234] и частичной очистки целевых ферментов.

Характерной чертой схем выделения гомогенных препаратов рестриктаз в части, касающейся хроматографических стадий очистки, является увеличение по сравнению с аналитическими опытами среднего их числа и набора используемых средств. Типичными для этих схем является наличие трех [72, 74, 106, 152, 184, 196] —четырех [13, 33, 34, 163, 234, 254] хроматографических стадий. Значительно реже встречаются схемы, включающие две [29, 127] —пять [138, 140] таких стадий. С количественной точки зрения (число хроматографических стадий) разница между препаративными и аналитическими опытами не является принципиальной, что свидетельствует о подборе эффективных схем очистки целевых ферментов. Сравнение качественных параметров (набор используемых сорбентов) технологии получения препаратов рестриктаз, различающихся по уровню очистки, убеждает, что для опытов по получению гомогенных препаратов рестриктаз характерным является увеличение ассортимента используемых средств. Наряду с широким применением в этих экспериментах сорбентов, традиционно используемых для функциональной очистки специфических эндонуклеаз: ФРИ [29, 72, 74, 80, 106, 138, 152, 163, 177, 184, 254, 298] и ДЭАЭц [13, 74, 107, 127, 138, 140, 177, 234, 299], относительно чаще встречается ГАП [72, 74, 107, 138, 152, 163, 177, 184, 196, 234, 254] и ГС [33, 127, 140, 177, 234, 299]. На сложность получения гомогенных препаратов указывает и частое использование в препаративных схемах гельфильтрации [13, 33, 74, 106, 107, 138, 299], хроматографии на ДНК-целлюлозе [163, 184, 196, 302] или ДНК-агарозе [152], СП-сефадексе, фенилсе-фарозе, w-аминопентилсефарозе [118, 138, 163, 254], голубой сефароэе [29, 234], карбоксиметилцеллюлозе [106] или ее аналоге Биорексе [254], т. е. частое использование таких сорбентов, которые в схемах выделения функционально очищенных препаратов рестриктаз встречаются значительно реже. Это явление следует рассматривать как выражение тенденции решить поставленную задачу путем поиска стадий, дающих эффективную очистку, т. е. путем включения в схемы выделения сорбентов, различающихся в отношении характера фракционирования исследуемой смеси растворимых клеточных компонентов.

О целесообразности использования более широкого ассортимента сорбентов свидетельствуют некоторые экспериментальные данные. Так, применение на первой хроматографической стадии выделения рестриктазы Нра I СП-сефадекса, позволило достигнуть исключительно высокой (850-кратной) ее очистки [118]. Введение гельфильтрации на сефадексе Г-100 на последней стадии выделения рестриктазы EcoR I дало 12-кратную

167

очистку [107]. Эффективным в отношении достигаемой степени очистки оказалось и использование ДНК-агарозы и^ ДНК, иммобилизованной в полиакриламиде, а также голубой сефарозы на последней стадии выделения рестриктаз Bsp I [152, 283], GceGL I [234] и Mva I [29] соответственно. Представленная в цитированных публикациях информация убеждает о высокой разделяющей способности вышеуказанных сорбентов и говорит о целесообразности их более широкого применения в опытах по получению функционально очищенных препаратов рестриктаз.

Рассмотренные выше примеры требуют некоторого пояснения. Анализируя данные, иллюстрирующие степень очистки целевого белка, следует иметь ввиду, что ее абсолютное значение зависит не только от эффективности сорбента, но и от того на какой стадии очистки он был включен в схему выделения. Особенно это замечание следует иметь в виду, оценивая результаты предпоследних и последних стадий очистки, когда целевой фермент составляет значительную часть в исследуемом белковом препарате. В таком случае использование даже высокоэффективного сорбента не может дать большей степени очистки, чем кратная доля выделяемого фермента в поступившем на него белковом препарате.

В опытах по получению гомогенных препаратов рестриктаз, как уже отмечалось, широко используется ФРП и ДЭАЭц — сорбенты, нашедшие применение в большинстве схем выделения функционально очищенных препаратов этих ферментов. Наличие количественных данных о выходах и степени очистки, достигаемой с использованием этих ионитов в препаративных опытах, убеждает в высокой эффективности хроматографии на ФР II, в основном использованной на первых стадиях очистки

страница 59
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.08.2019)