Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

се очистки, так и для количественной оценки стадий выделения. Поэтому развитие исследований по выделению гомогенных препаратов рестриктаз следует рассматривать и как «полигон», где отрабатываются новые методические подходы к очистке указанных ферментов, что, несомненно, вносит вклад и в развитие работ по получению функционально очищенных препаратов рестриктаз.

В области препаративной биохимии рестриктаз практически только в случае выделения гомогенных препаратов этих ферментов описание схем очистки сопровождается количественными данными, позволяющими оценить эффективность отдельных стадий и выход целевого продукта. Приложение усилий для получения таких сведений в определенной степени диктуется и необходимостью подбора эффективных стадий, обеспечивающих получение необходимых количеств гомогенных препаратов рестриктаз. Однако, при оценке схем их получения в целом следует отметить, что в связи с присутствием в бесклеточных экстрактах неспецифических нуклеаз количественное определение активности целевых ферментов во многих случаях оказалось возможным проводить только после частичной их очистки. Это исключает возможность оценки эффективности первых стадий и всей схемы в целом. Тем не менее наличие количественных данных последующих стадиях очистки является полезной информацией, позволяющей оценивать эффективность сорбентов.

Сводные данные о количестве использованной биомассы, абсолютном и относительном выходе ферментов по белку, степени очистки и относительном выходе по активности очищенных до гомогенного состояния рестриктаз представлены в табл. 22.

В таблицу не включена и дальше не рассматривается схема выделения рестриктазы Bstl503, разработанная Катереллом и" Уилкером [70]. При оценке этой работы приходится согласиться

11*

163

Таблица 22

Сводные данные о выходе и степени очистки рестриктаз, очищенных до гомогенного состояния

п/п Ростриктаза Количес -во сырой биомассы, из которого проводилось выделение, (г) Количество гомогенного белка Степень ОЧИСТКИ Выход, % Литература общее (мг) из 1 г биомассы (мкг) 1. Аху I 260 0,858 3,3 3 500 27 [302]

2. Ah I 150 0,84 0,6 4 000 43,8 299]

3. BamH I 500 2,0 4.0 1 750 19а> 254]

4. Bgl I 740 4,0 5.4 — — 163]

1 000 3.0 3.0 3806 15,6а 138]

5. Bon I 20 0,8 14.0 1 816 21а> 196]

6. Bgl и 250 1.7 6,8 — — 127]

7. BspR I 80 0.4 5,0 2 200 13а) 152]

50 0,4 8.0 1 600 18а) 283]

8. Bst I 70 000 38,0 0.54 1 797 17 [74]

9. Bsu I 70 0,077 1.1 7 100 18.5а [58]

10. GceGL I 170 1.55 9 645 41.7 234]

11. EcoR I 350 0.2 0.6 1 500 3.5 107]

3 200 27,0 8,5 1 180 21 184]

4 730 53,7 11,4 1 750 28 [228] 12. EcoR V 1000 5.1 5,1 _ _ [15] 20 60,0 30 000 — — [80] 13. EcoR II 300 3.4 11.3 256 10а) [13] 14. Hha II 25 0.75 30.0 327 13а) 140]

15. Нра I 100 0.06 0.6 17 000 34 118]

16. Mva I 15 0.22 14,6 860 32а 29]

17. Ngo II _ 0,34 — 38,8 12 72]

18. PaeR7 I 41 12,0 293 11 10 272]

19. Pal I 400 0,21 0,52 1 650 33 33]

20. SalG I — 0.15 — 105 0.8 177]

21. Taq I 2.4 26 10 833 — 43 34]

20. Xho I 600 0.5 0,83 — —¦ 15]

а — данные о степени очистки и выходе рассчитаны, начиная с первой стадии выделения.

(—) — сведения отсутствуют

с мнением Кларк и Гартлея [74], что был получен не гомогенный препарат рестриктазы Bst 1503, а препарат какого-то другого белка, содержащего примесь исследуемого фермента. Поэтому в сводной таблице содержатся только данные об очистке Bstl503, полученные последними авторами.

Как следует из данных, представленных в табл. 22, относительные выходы, рассматриваемые для тех случаев, когда оказалось возможным их рассчитать начиная с определения содер-

164

жания целевого фермента в грубых экстрактах, находятся в интервале 10% (EcoR II) —32% (Mva I). Такой в общем большой выход рестриктаз, учитывая необходимую для достижения их гомогенности многократность очистки (см. табл. 22), свидетельствует об эффективности разработанных схем.

Обращает на себя внимание тот факт, что масштабность процессов выделения рестриктаз (за исключением Bst I) является небольшой, а количество получаемых в конечном счете препаратов измеряется несколькими миллиграммами или даже долями миллиграммов.

Учитывая высокую чувствительность современных аналитических методов, используемых для изучения структурно-функциональных особенностей этих ферментов и механизмов их взаимодействия с ДНК, этих количеств достаточно для проведения таких опытов.

Количественных данных о содержании целевых ферментов при пересчете на гомогенный белок в биомассе продуцентов рестриктаз мало [13, 29, 58, 138, 140, 152, 196, 254]. В исследованных немногочисленных случаях эти значения приблизительно равны (мкг/г сырой биомассы продуцента): 6 — Bsu I [58], 44 —Bsp I [283], 45 —Mva I [29] и 68 — Ben I [196]. По этому показателю их превосходит только EcoR II, Hha II, PaeR7, EcoR V и Taq I. Сверхсинтез этих ферментов был достигнут благодаря успешному применению для конструирования продуцента методов генной инженерии [13, 34, 80, 140, 154, 272].

Высокая продуктивность штамма по отношению к целевому белку является важной предпосылкой для его получения в гомогенном состоянии. Однако, для ее реализации необходимо создать эффективную схему очистки. С учетом данных об абсолютных выходах рестриктаз (мкг/г биомассы), приведенных в табл. 22, можно рассчитать, что для получения 1 мг гомогенной Pal I (самый низкий выход — 0,52 мкг/г биомассы) необходимо было бы обрабатывать около 2 кг биомассы соответствующих продуцентов. Для получения по 1 мг большинства остальных, перечисленных в табл. 22 рестриктаз, понадобилось бы вести выделение из нескольких сотен грамм биомассы. Исключениями являются рестриктазы EcoR V, PaeR7 I и Taq I, выделяемые из генноннженерных продуцентов в количествах 3, 0,29 и 10,8 мг/г биомассы соответственно. Учитывая вышесказанное, использование в опытах по выделению гомогенных препаратов рестриктаз не столь уж и больших объемов биомассы, равняющихся десяткам [29, 58, 152, 196], сотням [13, 15, 33, 118, 127, 163, 254, 299, 302] граммов и реже одному — нескольким килограммам [15, 74, 138, 184, 228], позволяет получать необходимые количества целевых ферментов. Тем не менее, в подавляющем большинстве случаев эти объемы биомассы превышают на порядок таковые, обрабатываемые в ходе выделения функционально очищенных препаратов рестриктаз. Эти

165

различия находят отражение и в методических подходах, направленных на создание схем выделения гомогенных препаратов рестриктаз и их реализацию.

Кроме масштабности определенный вклад в специфику этих схем вно

страница 58
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(14.11.2019)