Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

157

об определенной роли биоспецифического взаимодействия в связывании рестриктаз с этим сорбентом.

Примеры реализации истинной гидрофобной хроматографии в ходе очистки рестриктаз, выражающейся в десорбции ферментов, связанных при высокой ионной силе, в условиях понижения концентрации солей в элюирующих растворах, немногочисленны.

В качестве гидрофобного сорбента в случае получения гомогенного препарата Bgl I [163] и функционально очищенных препаратов EcoCK I [27] и Sso47 II [18] была использована фе-нилсефароза. Элюция проводилась линейно понижающейся концентрацией сернокислого аммония. Использованная для очистки ряда рестриктаз [31, 100, 254, 303] w-аминопентилсефароза не может рассматриваться как гидрофобный сорбент, так как связывание целевых ферментов происходило только при пониженной ионной силе, а десорбция — при ее повышении. Дополнительным доводом в пользу этого утверждения являются сведения о характере взаимодействия Bgl I с фенилсефарозой [163] и w-аминопентилсефарозой [138], которое было гидрофобным в первом случае и ионообменным во втором.

Сведения о возможном участии гидрофобных взаимодействий с углеродной частью w-аминопентилсефарозы в хромато-графическом фракционировании рестриктаз, описанном в цитированных выше работах, отсутствуют. Таким образом, амино-пентилсефарозу можно рассматривать как второй (после ДЭАЭц) анионит, используемый для очистки ферментов рестрикции, что расширяет возможности варьирования процедур выделения целевых ферментов.

В большинстве случаев для получения функционально очищенных препаратов рестриктаз необходимо проведение 2— 4 стадий очистки, в том числе 1—3 хроматографических. Некоторые схемы выделения оказались приемлемыми для выделения многих рестриктаз. Среди таких можно отметить схемы, включающие стадию удаления нуклеиновых кислот гельфильтрацией или путем их высаждения при помощи СС или ПЭИ, высаливание сернокислым аммонием (не во всех случаях) и последовательную хроматографию на ФРП и ДЭАЭц в указанном или обратном порядке [28, 62, 89, 90, 92, 98, 104, 122, 156, 164, 166, 167, 180, 186, 218, 219, 220, 224, 225, 247, 262, 265, 271, 294, 296, 297 и др.]. Включение в схемы выделения наряду с указанными ионитами или вместо одного из них ГС [43, 44, 68, 85, 91, 130, 145, 173, 249, 262, 282, 293 и др.,] или ГАП [17, 23, 38, 88, 105, 202, 203, 209, 288 и др.] еще более расширяет список рестриктаз, очищенных с использованием ограниченного набора сорбентов. Реже в схемы очистки включается карбоксиметилцеллюлоза [106], ДНК-агароза/целлюлоза [58, 146, 174], w-аминопентилсефароза [31, 100, 303], фенилсефароза [18, 27], голубая сефаро-за [18, 32, 102, 211, 289], гельфильтрация с использованием се-

158

фадексов [9, 46, 172] и других носителей, предназначенных для разделительной хроматографии [47, 52, 126, 238, 243, 290].

Несмотря на общность приведенных выше схем очистки многих рестриктаз, она является в большей степени кажущейся, чем действительной. Это связано с тем, что в каждом конкретном случае необходим индивидуальный подход, выражающийся в подборе условий проведения той или иной стадии и выборе последовательности их применения. Вместе с тем по ходу развития работ по очистке рестриктаз выявилась тенденция создания именно унифицированных (универсальных) схем, пригодных для выделения многих рестриктаз без предварительного подбора условий проведения отдельных стадий и их последовательности. Иначе говоря, по тем или иным соображениям выбирается схема и проверяется ее пригодность для очистки ряда рестриктаз. Первыми этот подход реализовали Бикл с соавт. [43]. Их схема включала обработку бесклеточного экстракта ПЭИ в присутствии 0,1 М NaCl, последующее высаливание белков 70% насыщением раствора сернокислым аммонием, диализ и хроматографическое фракционирование на ГС (градиентная элюция 0,0—1 М NaCl). Применение такой процедуры, согласно утверждению авторов, позволило получить препараты большинства из 16-ти исследованных рестриктаз, по уровню функциональной чистоты пригодные для опытов по физическому картированию, а в некоторых случаях и для секвени-рования ДНК-

В 1978 г. Грин с соавт. [109] предложил методику очистки рестриктаз, включающую последовательное хроматографическое фракционирование на ФРП и ГАП. Бесклеточный экстракт на первый сорбент наносили без предварительного удаления нуклеиновых кислот. После проведения очистки по обсуждаемой схеме в 13-ти случаев из 16-ти испытанных были получены функционально очищенные препараты исследуемых ферментов, пригодных для использования в качестве аналитических реагентов.

Для получения аналогичных препаратов трех остальных ферментов оказалось необходимым ввести дополнительную стадию очистки, заключающуюся в хроматографии на катиони-те Биорекс 70.

К попыткам создания унифицированной схемы очистки рестриктаз можно отнести и работу Бекси [32], апробировавших с этой целью прямое фракционирование бесклеточных экстрактов четырех продуцентов рестриктаз различной таксономической принадлежности на голубой сефарозе. Однако, эффективность этого метода была продемонстрирована на небольшой группе рестриктаз и для определения его универсальности необходимы дополнительные исследования.

Все три обсуждаемые схемы выделения были апробированы в трех лабораториях, их разработавших. К сожалению, они не

3 59

нашли широкого распространения и поэтому трудно судить о границах их применения, которые несомненно существуют.

Рассмотрение литературных данных позволило выявить еще ряд схем очистки, которые применялись с незначительными вариациями условий проведения отдельных стадий очистки многих рестриктаз. Одной такой схемой является гельфильтрация грубого экстракта на Биогеле А — 0,5 м и последовательная хроматография на ДЭАЭц и ФРП, эффективность которой документирована по меньшей мере в случае очистки 9 рестриктаз: Atu I [225], Xma I и Xma II [92], Pvu II [104], Hha I [220], Xma III [156], Ара I [240], Atu В VI [224] и Sfa I [297]. В аналогичной другой схеме был изменен порядок использования вышеуказанных ионитов. По этой схеме (гельфильтрация на Биогеле, последовательная хроматография на ФРП и ДЭАЭц) были очищены следующие ферменты: Alu I [219], FnuD I, FnuD II [166], FnuH I [164] и HgiA I [62]. Для очистки рестриктаз Hinf I [271], Hind II [253], Hae III [218], BamH [113] и Hph I [151] была применена схема: гельфильтрация на Биогеле А—0,5 м, высаливание сернокислым аммонием и хроматографи-ческое фракционирование на ФРП.

При осуществлении некоторых стадий каждой из указанных схем условия проведения экспериментов незначительно варьировали. Если допустить, что эти вариации не являются существенными, то можно предположить их универсальный характер в том смысле, в каком этот термин принят в контексте настоящего обсуждения.

Очевидно, что создание истинно универсальных схем, пригодных для выделения многих рестриктаз, на данном методическом уровне препаративной биохимии белковых соединений является нереальной задачей. Однако, работы по апробации схем очистки, пригодных для выделения хотя бы

страница 56
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(17.11.2019)