Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

дполагается участие в связывании рестриктаз не только ионных, но и гидрофобных и аффинных взаимодействий. В отношении последних двух типов взаимодействия следует отметить, что они во многих случаях только постулированы, но не доказаны соответствующими экспериментами. Тем не менее, апробация новых сорбентов для очистки рестриктаз дала положительные результаты.

По вполне понятным причинам при поиске аффинных сорбентов внимание в первую очередь было обращено на субстрат рестриктаз — ДНК- В ряде случаев для очистки этих ферментов была использована колонка с однонитевой ДНК-агарозой, приготовленной смешиванием расплавленной горячей агарозы с денатурированной дезоксирибонуклеиновой кислотой тимуса теленка по методу Шеллера с сотр. [236]. Предполагалось [217], что с сорбентом преимущественно будут связываться неспецифические нуклеазы, а рестриктазы, субстратом которых является нативная ДНК, окажутся во фракции несорбировавшихся белков. Для некоторых рестриктаз это предположение, согласно утверждению Робертса [217], оправдалось и была получена хорошая их очистка. Наряду с этим было обнаружено, что некоторая часть исследованных специфических эндонуклеаз достаточно прочно связывалась с однонитевой иммобилизованной ДНК и элюировалась градиентом соли острыми пиками. В этом случае тоже наблюдалась значительная очистка этих ферментов от неспецифических нуклеаз. Хроматография на однонитевой ДНК, иммобилизованной на агарозе или целлюлозе, была применена на последней стадии очистки рестриктаз Hha I [174], Bsp I [152] и EcoR I [184]. В качестве сорбента для очистки специфических эндонуклеаз нашла применение и нативная ДНК, иммобилизованная на полиакриламидном геле или целлюлозе, которые были использованы в случае Bsu I [58] и Bbe I

155

[146] соответственно. В тех случаях, когда приводятся данные о степени очистки, достигаемой при хроматографическом фракционировании на ДНК сорбентах, они убеждают в высокой эффективности этой стадии в отношении очистки рестриктаз [158, 152].

Применение ДНК-сорбентов до сих пор носило эпизодический характер. Это было вполне объяснимо, учитывая необходимость их приготовления в лаборатории и нестабильность, чта ограничивает повторное их использование. В последнее время фирмой «Фармация» налажен выпуск ДНК-сефарозы, которая согласно рекламе допускает многократное применение. Возможно этот факт сыграет определенную роль в более широком использовании ДНК-сорбента в препаративной биохимии рестриктаз.

Предпосылкой для использования гепарина в качестве лиганда для очистки специфических эндонуклеаз послужили сведения об его ингибирующем действии на ряд ферментов, взаимодействующих с ДНК [75, 257]. Первым в практику препаративной биохимии рестриктаз гепарин, связанный с сефарозой, ввели Бикл с соавт. [43], продемонстрировавшие его эффективность в ходе выделения 16-ти ферментов.

Гепаринсефароза (ГС), по мнению авторов, имеет ряд положительных характеристик. Сорбент стабилен, легко регенерируется, может быть использован многократно, обладает хорошими проточными свойствами и высокой емкостью, что позволяет использовать колонки небольшого объема. К положительным свойствам ГС следует отнести и то, что согласно наблюдениям указанных исследователей, часть не специфических эндонуклеаз из бесклеточных экстрактов, полученных после удаления нуклеиновых кислот, или не связывалась с гепаринсефарозой, или элюировались преимущественно при более низкой ионной силе чем рестриктазы.

ГС является одним из немногих «аффинных» сорбентов, для которого была исследована природа взаимодействия с рестриктазами. Данные Имбера и Бикла [128] и Гинша с сотр. [120], которые установили, что рестриктазы Bgl II и BamH I конкурентно ингибируются гепарином, не противоречат предположению о биоспецифической сорбции по меньшей мере некоторых специфических эндонуклеаз на ГС.

После появления статьи Бикла с соавт. [43] ГС нашла широкое применение в схемах очистки многих рестриктаз [30, 91, 118, 130, 140, 142, 145, 146, 173, 196, 248, 249, 262, 289, 293 и др.].

В качестве лигандов для связывания рестриктаз были апробированы краситель цибакрон F3GA [32, 102], содержащий три сульфо-группы и сополимер пирана [102], представляющий собой дивиниловый эфир малеинового ангидрида, который в водных растворах гидролизуется с образованием соответствующей

156

поликарбоксильной кислоты, иммобилизованные на агарозе. Имеются указания, что оба эти соединения ингибируют активность рестриктаз [102]. Их структура (ароматические кольца, отрицательно зараженные группы) в какой-то мере может быть принята как имитирующая ДНК. С использованием этих сорбентов была продемонстрирована эффективная очистка ряда рестриктаз, сорбируемых непосредственно из неочищенных грубых экстрактов на голубой сефароэе (32] или на обоих обсуждаемых сорбентах после проведения стадии удаления нуклеиновых кислот [102]. В первом случае удается совместить стадию удаления нуклеиновых кислот и последующую хроматографи-ческую очистку целевых ферментов. К недостаткам голубой сефарозы и пирансефарозы следует отнести их низкую емкость по отношению к целевым ферментам, содержащихся в неочищенных препаратах [102].

Несмотря на довольно убедительные данные [102] об эффективности применения вышеуказанных сорбентов для очистки ряда рестриктаз, они практически не получили распространения в этой области препаративной биохимии ферментов. Хромато-графическое фракционирование на голубой сефароэе было включено как одна из стадий очистки рестриктаз Mra I [289] СИ I, Gal I и Gee I [121] и при получении гомогенных препаратов Pal I [33] и Mva I [29]. Пиран сефароза нашла применение в ходе выделения функционально очищенных Nsp рестриктаз из Nostoc РСС7524 [211].

Хроматографическая очистка, основанная на истинной биоспецифической аффинности исключительно к выделяемому белку, достигается при использовании иммуносорбентов. В литературе описано применение такого сорбента для очистки рестриктазы EcoR I [9]. Авторы этой работы проводили сорбцию фермента на колонке с антителами к EcoR I, иммобилизованными на сефароэе 4В, непосредственно из бесклеточных экстрактов. В результате последующей элюции в одну стадию удалось получить гомогенный препарат фермента. Широкому применению иммуносорбентов препятствует то, что для иммунизации необходимо располагать гомогенными препаратами рестриктаз.

В завершении обсуждения применения для очистки рестриктаз сорбентов, для которых или предполагается, или действительно реализуется биоспецифическая сорбция, хотелось бы обратить внимание на ФР II. В общем случае она представляет собой катионит, содержащий присоединенные к глюкозным остаткам целлюлозы фосфогруппы. В этом отношении этот сорбент в какой-то мере имитирует углеводно-фосфатный остов ДНК. Вопрос о движущей силе взаимодействия рестриктаз с этим сорбентом не исследован. Однако известные факты о сильном связывании фосфоцеллюлозой рестриктаз, являющихся кислыми белками, при значениях рН, значительно превышающих их изоточку [74, 120, 184, 196, 254] склоняют к предположению

страница 55
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.10.2019)