Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

зличной ионной силы обращает внимание на влияние значений обсуждаемого фактора на достижение поставленной цели. Упомянутое исключение относится к RMva I, для которой было определено, что оптимальная концентрация в оотношении сорбции фермента из грубых экстрактов на РП находится в интервале 0,2— 0,5 М NaCl и показано, что фермент не связывается с РП в отсутствии соли [29].

Имеются немногочисленные примеры применения для разделения нуклеиновых кислот и другого сорбента, содержащего катионообменные группы в составе лиганда цибакрона синего F3GA — голубой сефарозы, впервые примененной с этой целью Бекси с соавт. [32], для очистки четырех рестриктаз: BamH I, Pall, Xho I и Bgl I+П. В этих опытах грубые экстракты продуцентов указанных ферментов наносили на сорбент при низкой ионной силе. Нуклеиновые кислоты и значительная часть

152

неспецифических нуклеаз не задерживались голубой сефаро-зой, что позволило согласно утверждению авторов при последующей элюции градиентом концентрации соли получить довольно высокоочищенные препараты вышеуказанных ферментов, пригодных для специфического фрагментирования ДНК. Авторами цитированной работы было выдвинуто логичное предположение о приемлемости разработанной процедуры и в случае проведения первой стадии очистки других рестриктаз. Однако этот прогноз был подтвержден в единичных опытах [18] и обсуждаемый метод разделения нуклеиновых кислот и целевых ферментов распространения не получил. Возможно, что причиной этому является низкая емкость голубой сефарозы к рестриктазам, сорбируемым из грубых экстрактов [102], а также необходимость вести сам процесс из растворов низкой ионной силы [32]. Последнее условие вносит определенные ограничения на использование голубой сефарозы для обсуждаемых целей.

В завершение обсуждения методических приемов, используемых для разделения нуклеиновых кислот и рестриктаз, хотелось бы обратить внимание на некоторые вопросы. Взаимодействие рестриктаз и нуклеаз — основных интересующих исследователя компонентов грубого экстракта, с нуклеиновыми-кислотами, вносит ощутимый вклад в результаты экспериментов. Использование высокой ионной силы позволяет исключить-этот фактор в случае гельфильтрации и высаждения нуклеиновых кислот при помощи ПЭИ. Однако в этих условиях в общем случае должен наблюдаться переход во фракцию, содержащую рестриктазы, неспецифических нуклеаз. Поэтому, если цель эксперимента сводится не просто к разделению нуклеиновых кислот и рестриктаз, а к определенной функциональной очистке целевого фермента, более привлекательным является использование таких приемов, которые позволяют варьировать ионную силу. Перспективным в этом отношении является применение катионитов. При взаимодействии грубых экстрактов с катионитами нуклеиновые кислоты в общем случае должны оказаться в несорбированной фракции. Проведение процесса в условиях низкой или умеренной ионной силы призвано обеспечить удаление вместе с нуклеиновыми кислотами и определенной части иеспецифических нуклеаз. Хотя это специально и не оговорено, данные об эффективной функциональной очистке более десяти рестриктаз по схеме, разработанной Грин с соавт. [109], прошедших, вслед за стадией фракционирования грубых экстрактов на ФРП, хроматографию на ГАП, косвенно подтверждает это предположение.

Одним из путей реализации потенциальных возможностей хроматографических способов, позволяющих совместить в одной стадии гарантированное отделение нуклеиновых кислот и высокоэффективную очистку целевых ферментов, видится во введе-

153

нии в практику препаративной биохимии рестриктаз новых избирательных в этом отношении сорбентов. В результате проведенных исследований была продемонстрирована эффективность и перспективность применения для обсуждаемых целей гепаринсефарозы [30, 111, 196].

Удаление нуклеиновых кислот в некоторых случаях сопровождается заметной функциональной очисткой целевых ферментов [32, 109, 263]. Однако, по вполне понятным причинам выделение рестриктаз на этом этапе не завершается и для получения препаратов заданного уровня чистоты необходимо использование дополнительных приемов. Они будут рассмотрены в следующем разделе.

3.3. Методы, используемые для очистки рестриктаз

Во многие схемы очистки рестриктаз вводится стадия высаливания белков сернокислым аммонием. С применением этой процедуры решаются многие задачи: очистка, концентрирование разбавленных растворов, отделение рестриктаз от СС и ПЭИ. Так Муррей с соавт. [188] подобрали условия эксперимента, позволяющие разделить на этой стадии рестриктазы Ava I и Ava II, выделяемые из одной биомассы, которые переходили в осадок при 20—40% и 50—70% насыщении бесклеточного экстракта A. variabilis сернокислым аммонием соответственно. Примером другого варианта фракционирования высаливанием является работа Модрича и Забелы [184], где была использована экстракция белкового осадка, полученного при 70% насыщении грубого экстракта Е. coli RY13 солью, растворами со ступенчато понижающейся концентрацией сернокислого аммония. В результате проведения такой процедуры удалось повысить удельную активность целевого фермента в 2,7 раза. Фракционное высаливание белков нашло применение в схемах очистки многих рестриктаз [74, 98, 115, 118, 140, 142, 152, 173, 235, 247, 248, 296 и др.].

Высаливание часто применяется для концентрирования разбавленных растворов, содержащих рестриктазы, что может оказаться актуальным после проведения стадии удаления нуклеиновых кислот с использованием гельфильтрации [113, 152, 159, 218, 253 и др.]. В этих условиях обычно используются высокие концентрации сернокислого аммония, обеспечивающие полноту высаждения целевых ферментов, что, однако, исключает их очистку. Применение такого же варианта высаливания распространено в опытах, преследующих цель разделить рестриктазы и преципитирующие агенты [85, 89, 91, 142, 167, 186, 249, 262, 290, 291 и др.], которые могут интерферировать качественному проведению последующей хроматографической стадии (особенно на катионитах, связывающих СС и ПЭИ). Иногда удаление указанных агентов совмещается с очисткой

154

целевых ферментов. В таких случаях применяется фракционное высаливание [20, 23, 74, 243, 247, 299 и др.].

Во всех вариантах проведения высаливания (за исключением экстракции белковых осадков растворами сернокислого аммония) в разных экспериментах, преследующих различные цели, достигается концентрирование разбавленных растворов рестриктаз, что является удобным при переходе к хроматографи-ческим стадиям очистки.

Наиболее эффективным и распространенным способом очистки является хроматографическое фракционирование. Характерной чертой использования этого приема для очистки рестриктаз является то, что решение задачи получения функционально очищенных препаратов этих ферментов достигается путем применения ограниченного круга сорбентов. Наряду с «традиционными» сорбентами — ДЭАЭц, ФРП, ГАП, карбоксиметилцел-люлозой и носителями для гельфильтрации для очистки специфических эндонуклеаз в настоящее время используются и сорбенты, для которых пре

страница 54
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(12.12.2019)