Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

ия работ по очистке специфических эндо-цуклеаз [218, 219, 225, 253, 271 и др.].

Учитывая большую разницу в величине заряда белков (рестриктаз) и нуклеиновых кислот в общем случае и его знака в некоторых условиях, вполне понятным является привлечение для решения задачи разделения указанных компонентов иони-тов. В одной из первых работ применения с этой целью сорбентов, содержащих ионогенные группы, был использован ГАП {253], на который путем непродолжительного перемешивания с грубыми экстрактами ряда продуцентов из рода Haemophilus сорбировали рестриктазы и нуклеиновые кислоты. Фракционное промывание сорбента порциями элюирующих растворов повышающейся ионной силы позволило добиться отделения нуклеиновых кислот от целевых ферментов и достичь более чем десятикратной очистки последних. Однако, этот прием в дальнейшем не получил распространения, так как для решения обсуждаемых задач были подобраны более удобные в работе сорбенты. В качестве такого, хотя и редко, используется анио-нит ДЭАЭц.

Процедура разделения нуклеиновых кислот и рестриктаз с использованием ДЭАЭц проводится в двух вариантах: 1) при значениях ионной силы, исключающих задерживание на сорбенте целевого фермента и не препятствующих сорбции на нем нуклеиновых кислот — в условиях, обеспечивающих разделение целевых ферментов и нуклеиновых кислот уже во время контакта грубых экстрактов с анионитом; 2) в условиях, когда оба компонента связываются анионитом и их разделение осуществляется при последующей элюции с колонки.

Примеры применения ДЭАЭц для удаления нуклеиновых кислот в первом методическом варианте немногочисленны [58, 252, 288]. В случае рестриктазы Bsu I, грубые экстракты пропускали через колонку с указанным сорбентом при повышенной ионной силе (0,3 М К.С1) [58]. Целевой фермент был обнаружен в несорбировавшейся фракции. Нуклеиновые кислоты в указанных условиях проведения эксперимента оказались связанными с сорбентом. Разделение нуклеиновых кислот и рестриктаз Xor I и Xor II при помощи ДЭАЭц осуществлялось в присутствии 0,25 М КС1 [288]. После перемешивания суспензии ДЭАЭц в бесклеточном экстракте в течение 2,5 часов происходила полная сорбция ДНК. Целевые ферменты и незначительная часть РНК. в этих условиях оставались в растворе.

Несколько больше примеров работ, по сравнению с вышеуказанными, в которых применение ДЭАЭц не ограничивалось удалением нуклеиновых кислот из бесклеточных экстрактов. Взаимодействие необработанных грубых экстрактов [38, 178]

150

или грубых экстрактов, частично очищенных высаливанием [95, 125, 188, 248], с анионитом в условиях низкой ионной силы реализовывалось в связывании на ДЭАЭц не только нуклеиновых кислот, но и рестриктаз. Последующая элюция колонки растворами повышающейся концентрации соли позволил совместить хроматографическую очистку целевых ферментов со стадией удаления нуклеиновых кислот. В какой мере достигалась последняя цель судить трудно, так как соответствующие данные в цитированных выше работах не приводятся. Опасность хотя бы частичного перекрывания профилей элюции рестриктаз и нуклеиновых кислот реально существует. Так, например, наблюдалась совместная десорбция с ДЭАЭц рестриктазы EcoR I и нуклеиновых кислот при 0,65 М концентрации NaCl [48]. Цитированная работа содержит данные о том, что рестриктаза EcoR I, сорбированная на ДЭАЭц из растворов, не содержащих нуклеиновых кислот, элюируется при 0,1 М концентрации NaCl. Таким образом, связанные с анионитом нуклеиновые кислоты могут влиять на ход хроматографическо-го фракционирования рестриктаз. В общем случае это вряд ли является желательным, так как содержание нуклеиновых кислот и их распределение по молекулярным весам в грубых экстрактах или частично очищенных высаливанием препаратах являются трудно поддающимися стандартизации показателями. Вариация в содержании и полимерности нуклеиновых кислот от опыта к опыту может найти отражение в доле связываемого с ними целевого фермента, что может обусловить невоспроизводимость экспериментов. Наверно неслучайно в ряде случаев применению ДЭАЭц предшествовала очистка бесклеточных экстрактов путем их высаливания [95, 125, 188, 248 2881, что было призвано способствовать улучшению хроматографическо-го фракционирования целевых ферментов. Думается, что именно потенциально возможная невоспроизводимость и неоднозначность применения ДЭАЭц для разделения нуклеиновых кислот и рестриктаз сыграла определенную роль в довольно редком применении этого сорбента для достижения вышеуказанных целей.

ДЭАЭц связывает нуклеиновые кислоты за счет своих анио-нообменных групп. Как уже отмечалось, это приводит в некоторых вариантах выполнения опытов к одновременной сорбции на ионите как нуклеиновых кислот, так и целевых ферментов, что в принципе не исключает их взаимного загрязнения в ходе хроматографического фракционирования. Этим недостатком не обладают катиониты, в принципе неспособные связывать нуклеиновые кислоты за счет электростатических взаимодействий.

Одним из таких катионитов, используемых для совмещения стадии удаления нуклеиновых кислот и хроматографического фракционирования рестриктаз, является фосфоцеллюлоза

151

(ФРП), впервые апробированная с этой целью Грин с соавт. [109]. Ими на примере большой группы рестриктаз, выделяемых из 13 штаммов различной таксономической принадлежности, была продемонстрирована сорбция на ФРИ всех исследованных ферментов их грубых экстрактов, содержащих 0,1 или 0,2 М NaCl. Применение повышенной ионной силы в этих опытах было призвано разрушить комплекс нуклеиновые кислоты— рестриктазы и тем самым способствовать сорбции последних на ФРП. Последующая отмывка колонки исходным раствором дала гарантированное удаление нуклеиновых кислот, а элюция градиентом концентрации соли — эффективную очистку связанных ионитом целевых ферментов. Казалось бы появление указанной работы, столь наглядно демонстрирующей высокую эффективность проведения стадии разделения нуклеиновых кислот и рестриктаз, совмещенной с последущим хроматогра-фическим фракционированием последних, должно было вызвать цепную реакцию по широкому применению этого метода. Однако этого не произошло, хотя и имеется немало примеров успешного использования этого приема для очистки ряда рестриктаз: Rsr II [194], Cfrl3I [50], Fokl и Mlu I [260], Kpn I [17], EcoRV [80], Ddel [172], Cfr I [133], Cfr4 I и Ctrl II [30] и CfrlOI [132]. В случае пяти рестриктаз сорбция целевых ферментов из бесклеточных экстрактов осуществлялась из буферных растворов, не содержащих солей, а в случае получения рестриктаз Sna I [201] и Mme I [57], а также гомогенных препаратов BamH I [254] и Mva I [29] — растворы содержали пониженные или повышенные (0,04 М, 0,1 М и 0,08 М и 0,3 М соответственно) концентрации NaCl по сравнению с таковой (0,2 М), использованной в работе Грин с соавт. [109]. Причины, вызвавшие применение указанных модификаций метода Грин с соавт. [109], в цитированных статьях за одним исключением не обсуждаются. Однако, сам факт возможности (или необходимости) проведения этой стадии в растворах ра

страница 53
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.09.2019)