Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

полиэтилен-иминового метода в отношении высаждения нуклеиновых кислот. Однако, отмечены случаи, когда проведение такой процедуры не гарантирует последующей сорбции бесклеточного экстракта на ионитах из-за присутствия в них каких-то не-идентифицированных интерферирующих этому процессу клеточных растворимых компонентов [43]. Выходом из создавшейся ситуации оказалось использование вместо ПЭИ стрептомицин-сульфата или хроматографическое фракционирование грубых экстрактов на ДЭАЭц [43].

После проявления первых, цитированных выше работ, ПЭП нашел применение в ходе очистки многих рестриктаз [13, 47, 68, 83, 85, 89, 90, 249, 262, 280, 290 и др.]. В этих опытах используются оба обсужденных выше, варианта осуществления эксперимента. При работе с большими объемами биомассы предпочтение отдается варианту, позволяющему разделить нуклеиновые кислоты и целевые ферменты уже на стадии высаждения первых [127, 198]. Это объясняется некоторыми трудностями экстракции соосажденных рестриктаз из объемистых осадков, трудно поддающихся суспендированию.

Эффективным, давно известным способом разделения нуклеиновых кислот и белков, является использование двухфазных водных систем [2]. Однако, примеры использования таких систем в работах, посвященных решению этой проблемы в случае выделения рестриктаз, немногочисленны [119, 179, 202, 298]. Предположительно это связано с необходимостью подбора условий проведения экспериментов, обеспечивающих избирательное распределение компонентов разделяемой смеси между фазами и некоторыми сложностями при переходе на последующую стадию очистки.

10*

Вышеизложенные методы несомненно являются эффективными в отношении решения главной задачи этого этапа выделения ферментов рестрикции — разделения специфических эндонуклеаз и нуклеиновых кислот. Что же касается вопроса об эффективности этих процедур в отношении очистки целевого фермента, то обращение к литературным данным убеждает в практическом отсутствии соответствующих сведений.

Ранее обсуждался пример многократной очистки рестриктазы EcoR I после проведения стадии удаления нуклеиновых кислот при помощи ПЭИ [48, 263]. Скорее всего такая эффективность данной стадии в отношении очистки целевого фермента является исключением. Учитывая то, что фракционированию подвергается сложная смесь клеточных компонентов, содержащихся в грубых экстрактах, а используемые методы не являются избирательными, следует предположить, что в большинстве случаев достигается только эффективное удаление нуклеиновых кислот без сколько-нибудь значительной очистки рестриктаз. Поэтому те немногочисленные примеры работ, в которых приведены количественные данные относительно степени очистки рестриктаз обсуждаемыми способами [13, 127], не противоречащие выше указанному предположению, думается являются типичными.

Низкая эффективность вышеизложенных методов удаления нуклеиновых кислот в отношении очистки целевых ферментов и потенциальная возможность больших их потерь, а также некоторые методические трудности в подборе оптимальных условий проведения этих процедур послужили определенным стимулом для апробации возможности использования на этой стадии очистки рестриктаз хроматографических подходов.

3,2.2. Хроматографические методы разделения нуклеиновых кислот и рестриктаз

Применение хроматографических методов разделения нуклеиновых кислот и специфических эндонуклеаз основано на использовании с этой целью их разницы в молекулярных весах, значений и величин заряда. Учитывая определенную избирательность используемых с этой целью хроматографических материалов и то, что большая часть процессов по разделению нуклеиновых кислот и специфических эндонуклеаз осуществляется в одной стадии в колоночном режиме, следовало бы ожидать совмещения решения вышеуказанной задачи с определенной как функциональной, так и абсолютной очисткой рестриктаз от сопутствующих примесных нежелательных активностей и белков.

Наиболее простым хроматографическим приемом разделения нуклеиновых кислот и рестриктаз следует признать гель-фильтрацию бесклеточного экстракта. Эта процедура примени-

148

ма практически во всех случаях без предварительного подбора условий проведения эксперимента. Гельфильтрация обычно проводится на биогеле А — 0,5 м в растворах, содержащих 1 М NaCl [31, 62, 92, 104, 152, 166, 218—220, 224, 225, 267, 276, 289, 297 и др.]. В последнее время появились сообщения об использовании с этой целью сефакрила S—200 [47, 253], сефарозы 2В [180] или 6В [294, 295], а сам процесс иногда проводится при более низких концентрациях (0,2 М — 0,5 М) соли [46, 47, 180]. Обычно на колонки наносятся относительно большие объемы грубых экстрактов, составляющие 4—8% [151, 166, 180, 209, 219, 225 и др.] и даже больше 10% [92, 156, 253 и Др.] от общего объема фракционирующего геля. Эти объемы превышают оптимальные (1—2%), обеспечивающие реализацию эффективной разделительной хроматографии [94]. Поэтому гельфильтра-цию в указанном исполнении следует рассматривать как процедуру, направленную в первую очередь на разделение нуклеиновых кислот и рестриктаз. В связи с этим не следует ожидать высокой степени очистки целевых ферментов. В литературе практически отсутствуют количественные данные, документирующие обсуждаемые показатели в опытах по выделению рестриктаз. В случае Bsp I прирост удельной активности фермента после проведения гельфильтрации грубого экстракта В. sphaericus в типичных для таких опытов условиях составил 1,6 раза [152]. Более высокая степень очистки была достигнута после проведения разделительной хроматографии грубых экстрактов, содержащих рестриктазы Dpn I или Dpn II, которая равнялась 13-ти и 4-х кратной соответственно [159]. В последнем случае хроматография осуществлялась в условиях, оптимальных для фракционирования компонентов анализируемой смеси (объемы грубых экстрактов составили менее 0,5% от объема колонки, заполненной Биогелем А—0,5 м). Однако, такой вариант исполнения гельфильтрации в опытах по выделению рестриктаз является исключением. Поэтому в типичных условиях, принятых в опытах по разделению нуклеиновых кислот и специфических эндонуклеаз, не следует ожидать эффективности очистки последних, значительно отличающейся от таковой, наблюдавшейся в случае Bsp I [152].

Обсуждаемому способу удаления нуклеиновых кислот характерен ряд недостатков. Гельфильтрация практически применима при работе с небольшими количествами биомассы. Высокая ионная сила в этих опытах применяется с целью диссоциации комплекса нуклеиновых кислот и рестриктаз. Однако, в этих условиях диссоциируют и неспецифические нуклеазы, которые, учитывая специфику осуществления экспериментов по отделению нуклеиновых кислот методом гельфильтрации, ориентированных на грубое фракционирование, могут в значительной мере загрязнять целевые ферменты. О низком уровне очистки в таких опытах вообще говорилось выше.

149

Несмотря на вышеуказанные недостатки, разделительная хроматография как способ отделения нуклеиновых кислот от рестриктаз нашла довольно широкое применение, особенно на лервых порах развит

страница 52
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(09.12.2019)