Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

яющее наряду с удалением клеточных обломков перевести в осадок и рибосомы [198]. В доступной литературе имеется несколько примеров ультрацентрифугирования бесклеточных экстрактов при 250 000 xg 17 часов, примененного в случае выделения рестриктаз Nci I и Nde I [292, 293]. Очевидно, что в последнем случае достигается большая очистка целевых ферментов по сравнению с центрифугированием гомогената разрушенных клеток в других вышеуказанных режимах. Ультрацентрифугирование в режиме, обеспечивающем удаление рибосом, применяется довольно часто, что находит объяснение в достижении некоторой очистки целевых ферментов.

3.2. Разделение нуклеиновых кислот и рестриктаз

Для отделения нуклеиновых кислот от рестриктаз применяется их высаждение стрептомицинсульфатом (СС) или поли-этиленимином (ПЭИ), двухфазные водные системы, гельфильт-

144

рация и фракционирование грубых экстрактов на различных сорбентах, т. е. применяются две группы методов — нехромато-графические и хроматографические.

3.2.1. Нехроматографические методы

Одним из самых простых классических методов удаления нуклеиновых кислот является их высаждение при помощи СС. Обычно в опытах по выделению рестриктаз с этой целью используется 1—2% конечные концентрации указанного антибиотика. Для применения этого способа практически не существует ограничений в рабочих объемах бесклеточных экстрактов, что может оказаться важным фактором в препаративных опытах. Вышеуказанные особенности обсуждаемого метода удаления нуклеиновых кислот способствовали его широкому использованию в опытах по выделению рестриктаз [20, 23, 28, 52, 73, 98, 107, 115, 122, 126, 142, 145, 146, 167, 186, 234, 264, 265, 296, 303 и др.].

К недостаткам стрептомицинсульфатного метода следует отнести возможную потерю целевых ферментов. Следует предположить, что в каждом конкретном случае распределение нуклеиновых кислот и белков (в том числе нуклеаз, фосфатаз и рестриктаз) между осадком и раствором зависит от индивидуальных свойств этих компонентов и их проявления в условиях конкретного эксперимента. Предположительно соосаждение с нуклеиновыми кислотами может привести как к ощутимым потерям целевых ферментов, так и к их определенной функциональной очистке (в случае избирательного перехода в осадок нежелательных примесей). К сожалению, в литературе, описывающей применение СС для удаления нуклеиновых кислот в опытах по выделению рестриктаз, отсутствуют конкретные данные, отражающие характер распределения компонентов бесклеточного экстракта между осадком и супернатантом. Поэтому приходится лишь ограничиться замечанием, что наличие сведений об использовании в обсуждаемых экспериментах различных концентраций СС (0,5—4%) [115, 184, 186, 273] может быть принято как указание на возможность при ее помощи влиять на судьбу целевых ферментов и нежелательных примесей. В этом плане представляют интерес данные об ощутимых различиях в выходе рестриктазы EcoR I, выделенной по двум схемам [184, 273], что во многом может быть объяснено неодинаковыми потерями целевого фермента на стадии удаления нуклеиновых кислот, проведенной с использованием различных концентраций СС.

Комплекс СС—ДНК является неустойчивым в условиях повышенной ионной силы [87, 187]. Это его свойство ограничивает возможности вариации условий экспериментов в отношении обсуждаемого фактора с целью регуляции распределения ком-

10-5933 6

145

понентов бесклеточных экстрактов между надосадочной жидкостью и преципитатом и не допускает применения экстракции целевых ферментов из осадков растворами повышенной ионной силы.

Вышеуказанные ограничения стрептомицинсульфатного метода стимулировали поиск других способов удаления нуклеиновых кислот путем их высаждения, что учитывая простоту и возможность масштабирования, оставалось привлекательным приемом. Внимание было обращено на успешное использование полиэтиленимина (ПЭИ) для перевода нуклеиновых кислот в осадок в работах, посвященных выделению ферментов обмена нуклеиновых кислот [66]. Привлекательной стороной применения этого положительно заряженного полимера явилась устойчивость ДНК—ПЭИ комплекса в растворах высокой ионной силы, что снимает ограничения к вариации ее значений в довольно широком диапазоне.

В одной из первых работ [43], посвященных исследованию возможностей использования ПЭИ в опытах по выделению рестриктаз, было апробировано несколько вариантов его применения. Бикл с сотрудниками [43], с этой целью исследовали распределение 16-ти рестриктаз между осадком и супернатан-том после добавления ПЭИ (1%) в бесклеточные экстракты при низкой ионной силе (в отсутствие соли) и содержащие 0,1 М NaCl. В последнем варианте во всех случаях в надосадочной жидкости была обнаружена рестриктазная активность. Высаждение нуклеиновых кислот из бесклеточных экстрактов при низкой ионной силе дало неоднозначные результаты. Только в некоторых случаях перехода рестриктаз в осадок их затем удавалось экстрагировать солевыми растворами. В случае рестриктазы Bgl I использование для экстракции даже 0,5 М забуференного раствора NaCl не дало положительного результата, что привело к полной потере фермента. Проблема была решена путем высаждения нуклеиновых кислот из бесклеточного экстракта В. globigii, содержащего 0,1 М NaCl. В этом варианте выполнения опыта Bgl I остался надосадочной жидкости. Бикл с соавт. [43], к сожалению, не привели данных о количественной стороне распределения целевых ферментов между осадком и жидкой фазой в разных вариантах использованного метода удаления нуклеиновых кислот, что не позволяет судить об эффективности этого приема в отношении выхода целевых ферментов. Такие исследования были проведены при разработке схемы очистки EcoR I [48, 263]. В частности Бингхам с соавт. [48] показали, что в присутствии 0,025 М NaCl в растворе остается 0,1% от суммарной активности EcoRI в бесклеточном экстракте. Повышение концентрации соли до 0,3 М позволяет обнаружить в надосадочной жидкости всю рестрик-тазную активность, а в случае 0,1 М — только 28%. При всех использованных концентрациях соли (0,025 М — 0,3 М) ДНК.

143

практически полностью переходила в осадок, а около одной трети белков и одной пятой РНК оставались в растворе. Часть неспецифических нуклеаз при высаждении нуклеиновых кислот полиэтиленимином из растворов низкой ионной силы оставалась в растворе, что позволило на данной стадии добиться частичной функциональной очистки целевого фермента, полностью оказавшегося в осадке. На основе проведенных прелиминарных опытов была отработана методика соосаждения нуклеиновых кислот и рестриктазы EcoRI (0,1% ПЭИ, 0,025 NaCl) и последующей элюции фермента 0,3 М забуференным раствором NaCl, позволившая добиться двадцатикратной очистки целевого фермента с выходом, превышающим 70%.

В одновременно появившейся работе Сумеги с соавт. [263] подбор условий осаждения EcoR I и нуклеиновых кислот полиэтиленимином и последующей элюции целевого фермента тоже реализовался в аналогичных выходах и степени очистки указанной рестриктазы.

Не вызывает сомнений высокая эффективность

страница 51
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.09.2019)