Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

оличество фосфатаз. Уровень присутствия неспецифических нуклеад ограничивается та-

141

ким их содержанием в препаратах рестриктаз, который бы не искажал картины распределения фрагментов на электрофоре-грамме. Рестриктазы, используемые в опытах по генной инженерии и секвенированию ДНК, должны характеризоваться очень высокой функциональной чистотой. Для изучения ряда физико-химических и энзиматических свойств рестриктаз, а также исследования механизмов их взаимодействия с ДНК необходимы гомогенные препараты этих ферментов.

Преобладание прикладных аспектов в исследованиях, посвященных ферментам рестрикции, находит свое отражение и в том, что в опытах по препаративному получению специфических эндонуклеаз основные усилия направлены на выделение функционально очищенных их препаратов. Значительно меньше внимания уделяется получению этих ферментов в гомогенном состоянии.

Рассмотрение известных схем выделения рестриктаз сталкивается с определенными трудностями. Отличительной чертой препаративной биохимии специфических эндонуклеаз по сравнению с традиционной практикой выделения многих других ферментов, является скудность количественных данных, характеризующих степень очистки и выход целевого продукта как на отдельных стадиях, так и после реализации всего процесса выделения, т. е. отсутствие критериев, обычно используемых для эффективности схемы очистки. Не принято проводить и оценку степени функциональной очистки на всех стадиях выделения, а тем более в многочисленных фракциях, собираемых в результате проведения хроматографического процесса. Такому анализу обычно подвергается только конечный препарат.

Существует несколько объективных причин наблюдаемого явления. В первую очередь это связано с тем, что в начальных стадиях очистки наличие в исследуемых препаратах примесных неспецифических нуклеаз не позволяет, за редкими исключениями, проводить количественную оценку активности рестриктаз. Но даже в случае потенциальной возможности такой оценки, отсутствие простых методов для ее осуществления не способствует проведению обсуждаемого анализа. Количественная оценка примесных неспецифических нуклеаз (особенно эндонуклеаз) тоже встречается с методическими трудностями.

Наиболее широко в опытах по выделению рестриктаз применяется электрофоретический метод [241], использование которого позволяет идентифицировать фракции, содержащие основную массу целевого фермента, и визуально оценить наличие примесей неспецифических нуклеаз. Учитывая тот факт, что основным направлением препаративной биохимии рестриктаз является получение небольших количеств функционально очищенных их препаратов, применение качественного метода (электрофоретического) является вполне оправданным. Однако,

142

повсеместное применение такого методического подхода не-позволяет на основе литературных данных, за редкими исключениями, оценить эффективность отдельных стадий оичстки и тем более сравнить с этой точки зрения разные схемы выделения рестриктаз. Указанные исключения в основном относятся к опытам по получению гомогенных препаратов этих ферментов.

Источником специфических эндонуклеаз являются штаммы микроорганизмов, каждый из которых, учитывая исключительную пестроту таксономической их принадлежности (см. разд. 2, 1-ая часть), в общем случае содержит уникальную композицию белков и других растворимых клеточных компонентов. Рестриктазы a priori отличаются по физико-химическим свойствам. Это утверждение предположительно справедливо и в отношении многих изошизомеров. Поэтому очевидно, что в общем случае выделение и очистка каждого отдельно взятого фермента является индивидуальной задачей. Однако, рассмотрение литературных данных позволяет выделить некоторые общие используемые с этой целью методические приемы.

Основными этапами выделения любой рестриктазы является получение бесклеточных экстрактов и собственно очистка целевых ферментов, осуществимая с применением традиционных приемов препаративной биохимии белковых соединений (высаливание, хроматографическое фракционирование и т. д.). Вместе с тем следует отметить, что процессам выделения рестриктаз, как и других ферментов нуклеинового обмена, характерен ряд специфических особенностей. В первую очередь это замечание относится к тому вниманию, которое уделяется разделению целевых ферментов и нуклеиновых кислот, в принципе способных влиять на перераспределение как рестриктаз, так и нуклеаз между фракциями, получаемыми в результате применения различных методов выделения целевых ферментов. Поэтому этот этап является одним из ключевых в схемах выделения рестриктаз, от результатов проведения которого во многом зависит успех дальнейшей их очистки.

Все этапы выделения рестриктаз (в том числе и центрифугирование гомогената разрушенных клеток), в зависимости от условий их проведения, могут дать в той или иной мере выраженную очистку целевых ферментов. Это замечание относится и к методам, применяемым для разделения нуклеиновых кислот и рестриктаз. Однако, в связи с отмеченной выше важностью этой процедуры для препаративной биохимии обсуждаемых ферментов по методологическим соображениям уместным является ее рассмотреть отдельно.

С учетом вышеуказанного в качестве основных этапов выделения рестриктаз будут рассмотрены следующие: получение бесклеточных экстрактов, разделение нуклеиновых кислот и целевых ферментов и хроматографическая очистка последних.

143

3.1. Получение бесклеточных экстрактов

В подавляющем большинстве случаев в опытах по выделению рестриктаз для разрушения клеток используется ультразвук [31, 100, 106, 126, 152, 186, 218, 219, 249, 288]. Иногда клетки перед этим обрабатывают лизоцимом [20, 28, 31, 123, 126, 146, 152] или лизостафином [264, 265]. Реже поставленная цель достигается при помощи Френч пресса [89, 169, 235, 289]. Имеются указания на использование в единичных случаях растирания клеток со смесью алюминия [113] и разрушение при помощи стеклянных шариков [88, 180].

В тех случаях, когда выделение рестриктаз ведется из сотен грамм или килограммовых количеств биомассы, для разрушения клеток применяются экструзионные механические дезинтеграторы [47, 74, 125, 138, 184, 188, 254].

Для экстракции рестриктаз, расположенных в периплазма-тическом пространстве грамотрицательных клеток, был апробирован их осмотический шок [179, 251], что нашло применение при разработке схемы очистки рестриктазы Pst I [251]. В дальнейшем этот метод в препаративных работах по выделению рестриктаз не получил распространения, что, учитывая ограниченный выход целевых ферментов в раствор [251] и относительную трудоемкость обсуждаемой процедуры, является вполне объяснимым.

Следующим этапом получения бесклеточных экстрактов является центрифугирование клеточных гомогенатов. Обычно с этой целью используется высокоскоростное центрифугирование (10 000—50 000 xg 15—60 мин) [10, 100, 123, 125, 188, 296], обеспечивающее удаление клеточных обломков или ультрацентрифугирование, при 100 000 xg в течение 1—2 часов [78, 101, 149, 156, 179, 202, 218, 219, 235, 241 и др.], позвол

страница 50
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(19.10.2019)