Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

между обсуждаемыми подходами имеются и на стадии пермеализации клеток. В последнем случае обработка является одноэтапной (15 мин при комнатной температуре) и клетки суспендируются в буферном растворе, содержащем в качестве пермеализующих агентов Тритон Х-100, ЭДТА и лизоцим.

Метод отличается большой чувствительностью. Сказанное иллюстрирует тот факт, что в случае проверки в качестве модельного объекта продуцента рестриктазы Fok I F. okeanokoi-tes, отличающегося низким содержанием целевого фермента в биомассе (250 ед./г сырой биомассы), на электрофореграмме наблюдается типичная картина проявления специфической эн-донуклеазной активности. Отличительной чертой экспресс-метода является пока непревзойденная (а по отношению к многим другим подходам и просто не сравнимая) производительность, характеризующаяся возможность в одном опыте, продолжающемся 3—4 часа проверить до 100 отдельных колоний бактерий [3].

Как и в случае метода Уайтхеда и Брауна [294], далеко не все штаммы, относящиеся к различным таксономическим группам микроорганизмов, оказались чувствительными к используемой обработке. Среди проверенных культур положительные результаты были получены со штаммами, принадлежащими к родам Bacillus, Kurtia, Paracoccus, Vibrio, Pseudomonas, Rhodo-pseudomonas, Providencia, Flavobacterium; отрицательные со Streptomyces и Nocardia.

Хотя экспресс-методы скрининга штаммов микроорганизмов на наличие рестриктаз по вышеизложенным причинам не являются универсальными (как и все остальные методы) их максимальная простота позволяет предположить о возможностях широкого их применения в опытах по поиску продуцентов рестриктаз. На основе цитированных работ создается впечатление, что они пригодны для проверки широкого круга таксонов. Случаи отсутствия пермеализации могут быть идентифицированы визуально (например, по отсутствию в экстрактах клеточ-

139

ных нуклеиновых кислот или неспецифических нуклеаз) и клетки подвергнуты другим методам вскрытия.

Резюмируя рассмотрение методических аспектов поиска специфических эндонуклеаз хотелось бы обратить внимание на еще некоторые принципиальные возможности и недостатки биологического и биохимического подходов. Использование обоих методов не дает полной гарантии, что во всех случаях при наличии в исследуемой культуре целевого фермента он будет выявлен. Очевидно, что этими методами могут тестироваться только те специфические эндонуклеазы, для которых в используемых субстратах имеются узнаваемые ими последовательности нуклеотидов. В случае биологического метода набор субстратов ограничен фагами, способными размножаться и дать лизис на исследуемом штамме. Это ограничение значительно сужает возможности вариации субстратов, тем более, что, как указывалось, наблюдается тенденция отбора фагов с уменьшенным числом сайтов, узнаваемых ферментами СХС их хозяев [141]. В случае же применения биохимических методов теоретически не существует препятствий для использования различных по первичной структуре субстратов и, тем самым, при достаточно большом их наборе можно надеяться значительно уменьшить вероятность отрицательного результата в опытах по поиску продуцентов рестриктаз, обусловленного обсуждаемой причиной.

В случае использования биологических методов, как следует из приведенных выше примеров, огромное число штаммов исключается из круга исследуемых уже на первых стадиях проверки. Биохимической проверке доступны все штаммы. Однако, и в этом случае существует множество причин, по которым имеющиеся в клетках специфические эндонуклеазы могут быть не обнаружены. Вряд ли все их можно предусмотреть и перечислить. Среди очевидных причин видимого отсутствия искомой активности (кроме упомянутого выше отсутствия сайтов узнавания в субстрате) в опытах in vitro можно перечислить следующие: отсутствие сайтов узнавания может иммитировать-ся природными модификациями субстратов как в виде метилирования, так и более сложными ее вариантами [19, 155]. Предположительно часть рестриктаз может инактивироваться в ходе получения бесклеточных экстрактов или маскироваться присутствием большой, относительно рестриктазной, активностью неспецифических нуклеаз. Несмотря на исключительно высокую чувствительность электрофоретического метода [241], из-за маскирующего действия нуклеаз она может только снизиться. Проявление последнего фактора особенно должно сказаться на обнаружении рестриктаз, содержащихся в клетках в незначительных количествах. Состав рестрикционных смесей, используемых для определения активности рестриктаз в опытах по их поиску, может оказаться далеко не оптимальным. В ка-

140

честве кофактора в реакционной смеси обычно добавляются только ионы магния. Не исключено существование в природе специфических эндонуклеаз, имеющих другие кофакторные потребности. Такие ферменты в общепринятых для поиска рестриктаз реакционных смесях заведомо не будут тестироваться.

В принципе существуют методические подходы, позволяющие хотя бы частично проверить возможное влияние некоторых из вышеперечисленных факторов на наблюдаемый отрицательный результат путем вариации условий экспериментов. Однако осуществление таких опытов в большинстве случаев связано с выполнением многочисленных и трудоемких экспериментов.

В поиске путей решения вышеперечисленных вопросов определенный вклад могут внести биологические методы поиска СХС. Известны случаи, когда достоверно биологическими методами доказано существование СХС, но определить эндонукле-азную активность in vitro не удается [81, 150, 265]. Причины этого явления могут быть тривиальными (например, инактивация ферментов в бесклеточных экстрактах) или более сложными (потребность в неизвестном кофакторе (—ах)). Целенаправленное изучение причин этого явления могло бы способствовать поиску подходов в решении проблемы «тестируемости» хотя бы части рестриктаз биохимическими методами.

3. ОЧИСТКА РЕСТРИКТАЗ

Очищенные препараты рестриктаз необходимы как для их характеристики, так и для использования в качестве аналитических реагентов в различных сферах применения этих ферментов. Выделение рестриктаз, как и любых других ферментов, преследует две цели — получение ферментных препаратов, свободных от нежелательных примесных активностей (функциональная чистота), или получение гомогенных белков (физическая чистота). В случае специфических эндонуклеаз в качестве нежелательных примесей в первую очередь выступают неспецифические нуклеазы и фосфатазы, имеющиеся во всех клетках, а иногда и рестриктазы, присутствующие наряду с целевым ферментом в биомассе некоторых продуцентов.

Требования к уровню функциональной чистоты препаратов рестриктаз, используемых в опытах по определению их субстратной специфичности, далеко не одинаковы и диктуются заданной глубиной исследования этой характеристики. В случае применения рестриктаз в качестве аналитических реагентов качество препаратов, в зависимости от сферы применения, тоже может варьировать. В опытах по физическому картированию допустимо использование ферментов, содержащих в качестве примесей нелимитированное к

страница 49
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(12.11.2019)