ивной ДНК служило мерой рестриктазной активности. Аналогичный принцип определения активности исследуемых ферментов был апробирован Дефилли-пес-сом [86]. В этом случае для разделения субстрата — плазмид-ной кольцевой ДНК и продуктов реакции был применен гидро-ксиапатит.

Другой вариант количественной оценки разрыва ДНК реализовали Модрич и Забела [184], использовавшие в качестве субстрата ДНК плазмиды ColE I. Указанные авторы ввели в реакционную смесь эндонуклеазу гесВС, которая действовала только на линейную ДНК (продукт рестриктазной реакции) и переводила ее в кислото-растворимую фракцию, содержание метки в которой отражало активность рестриктазы EcoR I.

Грин с соавт. [106] для определения активности этого же фермента, наряду с ДНК вируса ОВ40, в качестве субстрата использовали синтетический октануклеотид, меченный 32Р, содержащий участок, узнаваемый этим ферментом. Измерение содержания метки в продуктах реакции, разделенных методом электрофореза на бумаге, позволило количественно оценивать активность исследуемого фермента.

Определение активности рестриктаз, основанное на использовании кольцевых ДНК молекул [106, 107], применимо

128

только к некоторым ферментам, для которых удается подобрать сравнительно небольшого размера субстраты, содержащие ограниченное число точек расщепления. Иначе говоря, в каждом конкретном случае попытка использования вышеуказанных методов предполагает поиск доступного субстрата, удовлетворяющего вышеуказанным требованиям. Более общий подход к количественной оценке рестриктаз был предложен Беркнером и Фолком [40, 41]. С этой целью ими была использована способность полинуклеотидкиназы Т4 катализировать в определенных условиях обмен 5'-фосфата в молекулах ДНК на Ч"ФосФат АТФ [40]. Соответствующими опытами было продемонстрировано, что количество введенной в рестрикты метки из [f-32P]-АТФ пропорционально содержанию ДНК концов, образовавшихся в результате действия рестриктаз на субстрат. Метод оказался приемлемым для определения активности ферментов рестрикции, образующих как 5' или 3' выступающие, так и полностью спаренные концы ДНК на месте ее расщепления.

Все рассмотренные количественные методы определения активности рестрикционных ферментов выполняются путем отбора проб в ходе реакции и их анализа. Халфордом и Джонсоном [114] был предложен и реализован на примере REcoR I непрерывный способ регистрации кинетики реакции. Он основан на разной способности связывать этидиум бромид сверх-скрученной и никированной формами кольцевых молекул ДНК. Это приводит к изменению флуоресценции, что и регистрируется при помощи флуориметра.

Резюмируя рассмотрение количественных методов определения активности рестриктаз, следует отметить, что они являются адекватными приемами для изучения кинетических параметров катализируемых этими ферментами реакций. Несомненно, что в аналогичных опытах они найдут применение и в будущем. Однако, их использование в таких экспериментах, как, например, очистка рестриктаз и изучение влияния условий культивирования на содержание целевых предметов в биомассе, является малопривлекательным. Это, кроме отмеченных выше ограничений, выражающихся в необходимости подбора в каждом конкретном случае подходящих субстратов, обуслов-ленно трудоемкостью приготовления таких субстратов (это замечание особенно касается радиоактивных субстратов) и анализа продуктов реакции. На всех этих этапах необходимо располагать уникальной аппаратурой и возможностью работать с изотопами. Хотя часть из обсуждаемых методов и была использована в единичных опытах по очистке рестриктаз [106, 163, 184, 254,], по вышеизложенным причинам они распространения не получили. Их трудоемкость является очевидной, а выигриш в точности определения в таких опытах по сравнению с электрофоретическим методом не окупает затрат.

Вышеупомянутыми недостатками не обладает спектрофото-

9—5933

6

129

метрический метод [134], нашедшийi применение в экспериментах по очистке рестриктаз [29, 196]. В качестве субстрата используется нативная ДНК иммобилизованная на целлюлозе. Под воздействием рестриктаз ДНК высвобождается с матрицы. Измерение оптической плотности растворов, содержащих продукты реакции, при длине волны равной 260 нм, позволяет количественно в условных единицах оценивать активность исследуемых ферментов. Продемонстрирована применимость обсуждаемого метода для количественного определения активности рестриктаз самой различной специфичности [29, 134, 196]. Этот метод отличается простотой и требует для своего использования несложной аппаратуры. Спектрофотометрический метод нашел применение в ходе разработки и реализации схем очистки ряда рестриктаз [29, 196].

Известен другой количественный метод определения активности рестриктаз, тоже основанный на применении иммобили-зированной ДНК [229]. Однако в последнем случае используется радиоактивная ДНК заполимеризованная в полиакриламидном геле. Этот метод уступает спектрофотометрическому в универсальности, так как он применим только к частощепящим рестриктазам. Кроме того его применение связано с использованием радиоактивного субстрата.

Как уже отмечалось (и это имеет принципиальное значение), электрофоретический метод позволяет в одном опыте, путем рассматривания гелей, дифференцировать специфическую и неспецифическую нуклеазные активности и наличие нескольких рестриктаз. Конечно, рассмотренные выше количественные методы после соответствующих их модификаций можно адаптировать и для решения таких задач. Однако, это еще более усложнило бы их применение. Поэтому в опытах по поиску продуцентов рестриктаз и в значительной мере в экспериментах по их очистке электрофоретический метод не имеет себе равных.

2. ПОИСК ПРОДУЦЕНТОВ РЕСТРИКТАЗ

Основная масса известных специфических эндонуклеаз была обнаружена в результате целенаправленного применения для их поиска биохимических методов тестирования, основанных на определении способности грубых или частично очищенных бесклеточных экстрактов исследуемых культур специфически фрагментировать ДНК субстраты. Значительно меньшее число этих ферментов было выявлено благодаря изучению энзимати-ческих основ систем хозяйской специфичности (СХС) прокариотических микроорганизмов, реализовавшихся в открытии рестриктаз II типа. В последнем случае таким опытам предшествовали генетические (биологические) эксперименты по определению наличия и изучению генетического контроля систем

130

рестрикции-модификации у прокариотических микроорганизмов классическими методами, основанными на определении эффективности посева тестерных фагов на исследуемых и контрольных штаммах.

2.1. Биологические подходы к поиску продуцентов рестриктаз

По ряду причин, которые будут рассмотрены ниже, биологический подход, в отличие от биохимического, для целенаправленного поиска продуцентов специфических эндонуклеаз за редкими исключениями не применялся и их выявление оказалось как бы «побочным» продуктом исследований, посвященных отдельным аспектам поиска и изучения СХС. Среди таких исследований, имевших различные п