Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

стве аналитических реагентов. Рестрик-тирующие эидоиуклеазы всех типов отличаются исключительно высокой субстратной специфичностью — каждая узнает последовательность нуклеотидов строго определенной длины и состава. Основное различие между ними заключается в характере расщепления субстрата. В случае рестриктаз I типа это происходит в стороне от узнаваемого участка на большом расстоянии (более 1000 пар нуклеотидов) и случайным образом (179, 269), что исключает возможность использования этих ферментов для специфического фрагментирования ДНК.

Рестриктазы III и IV типов разрыв фосфодиэфирной связи ДНК производят на строго фиксированном расстоянии (24—26 и 14—16 нуклеотидных пар) в стороне от узнаваемого участка J69, 158, 292]. В результате образуется набор гомогенных фраг-

11

ментов субстрата. Однако использование этих ферментов в качестве аналитических реагентов не нашло распространения. Это объясняется тем, что никогда не наблюдается исчерпывающего гидролиза ДНК по всем участкам узнаваемыми рестрик-тазами III—IV типов. Поэтому получается набор фрагментов (хотя и ярко выраженных), характерный для неполного расщепления субстрата, который трудно поддается интерпретации. Аналогично субстрат фрагментируют немногочисленные эндонуклеазы, обнаруженные в эукариотических клетакх — у хламидомоны [100] и дрожжей [343, 388].

Вышеуказанными недостатками не обладают рестриктазы II типа. Нуклеотидные последовательности, узнаваемые этими ферментами, состоят из 4—8 нуклеотидных пар и отличаются вращательной симметрией второго порядка. Эти ферменты расщепляют ДНК полностью по всем узнаваемым участкам. Некоторые специфические эндонуклеазы способны узнавать ассиметричную последовательность нуклеотидов и расщеплять ДНК на расстоянии 5—13 пар оснований в сторону от узнаваемого участка. В других случаях узнаваемая последовательность нуклеотидов является прерванной — симметричные участки разделены любыми нуклеотидными парами. Однако, во всех случаях, вне зависимости от структурных особенностей узнаваемого участка, наблюдается исчерпывающий гидролиз ДНК. Способность рестриктаз II типа высокоспецифично и исчерпывающе расщеплять ДНК на фрагменты, соответствующие по длине расстояниям между узнаваемыми участками, предопределило широкое использование этих ферментов в качестве аналитических реагентов в исследованиях, в той или иной мере связанных с изучением и характеристикой структуры ДНК и в опытах по генетической инженерии. Именно рассмотрению этих ферментов посвящен настоящий обзор.

2. РАСПРОСТРАНЕНИЕ РЕСТРИКТАЗ

Первые рестриктазы были выявлены у представителей прокариотических микроорганизмов [312, 354, 412]. Попытка обнаружить специфические эндонуклеазы в низших эукариотах Tetrahymena, Oxytricha, Sacch. cerevisiae, предпринятая в начале развития работ по поиску продуцентов рестриктаз, дала отрицательный результат [312]. В последующем японскими исследователями было проведено более тщательное исследование в этом отношении 42 штаммов дрожжей Saccharomyces и Pichia, в результате которого было выявлено несколько культур, содержащих эндонуклеазы, специфически фрагментирую-щие ДНК [388]. Однако, глубина гидролиза субстрата этими ферментами не является исчерпывающей, чем они напоминают рестриктазы III типа [343]. Аналогичными свойствами облада-

12

ла эндонуклеаза, обнаруженная в клетках Хламидомонад {100].

Таким образом долгое время бытовало мнение, что ферменты рестрикции — модификации II типа являются характерными только для прокариотических микроорганизмов. Совершенно недавно этот вывод потребовал ревизии. Имеются в виду исследования, проведенные 'Ван Эттеном и др. [403—405], в результате которых такие ферменты были выявлены в эукариотических клетках — хлорелоподобных зеленых водорослях. Другим неожиданным следствием этих работ явился тот факт, что метилазы и рестриктазы кодируются генами вирусов, инфицирующими вышеуказанные клетки, что является нехарактерным для локализации прокариотических генов рестриктаз (например, в бактериофагах). Известна только одна система, а именно III типа, которая локализована в фаге Р I — это RMEcoP I [69, 79]. Больше примеров фаговой локализации генов метилаз, не являющихся составными компонентами систем рестрикции — модификации [214].

В 1985 году появилась публикация китайских авторов о наличии рестриктазной активности II типа со специфичностью EcoR I в клетках эмбриона человека [390]. Ферменту дано название Hsa I (от Homo sapiens). Ничего в этой работе не говорится о наличии или отсутствии в этих клетках сопряженной метилазы. Учитывая нетривиальность этого открытия и большое его общебиологическое значение некоторое удивление вызывает отсутствие за прошедший период попыток углубить и расширить исследования в этом направлении (в доступной литературе публикаций, касающихся этого вопроса не было обнаружено) . Следует предположить, что определенную роль в этом могло сыграть сообщение данных в малораспространенном журнале [390], а также возможное скептическое отношение некоторых исследователей к самому результату. Действительно публикация со столь нетривиальным результатом могла бы быть сопровождена более углубленными исследованиями (контрольными экспериментами), доказывающими однозначную истинность полученного результата — наличие рестриктазы в человеческих клетках, а не, например, в экзо- или эн-доклеточной прокариотической микрофлоре, заразившей исследуемый материал.

Ничто не препятствует проведению таких экспериментов. Поэтому следует ожидать либо подтверждения, либо опровержения данных о наличии специфических эндодезоксирибону-клеаз (а, возможно, и метилаз) II типа в человеческих (и других животных) тканях.

Уже первые опыты по поиску продуцентов специфических эндонуклеаз, последовавшие за открытием первой рестриктазы II типа — Hind II в Н. influenzae Rd [354], продемонстрировали как их широкое распространение в этом роде микроорганиз-

13

мов [750, 339], так и их наличие у представителей других таксонов—Escherichia [412], Moraxella [312] и Bacillus [342]. Открытие рестриктаз у бацил, относящихся в отличие от первых, к грамположительным микроорганизмам, указывало на возможное широкое распространение этих ферментов.

Таксономические границы потенциальных продуцентов рестриктаз были еще более расширены после их обнаружения в штаммах Anabaena [312], относящихся к другому большому разделу царства прокариотических микроорганизмов — циано-бактериям. Эти результаты указывали на возможность наличия специфических эндонуклеаз у представителей самых различных таксономических групп прокариотических микроорганизмов, что и было подтверждено последующими исследованиями. Довольно наглядно динамика роста таксонов и штаммов, в которых были обнаружены рестриктазы, прослеживается в публикуемых, начиная с 1976 г., списках этих ферментов, составляемых Робертсом [319—319]. Из таблицы 2, обобщающей сведения, имеющиеся в указанных списках, (а также дополнительные данные, не вошедшие в них) видно, что за 12 последних лет число видов и родов, в которых найдены рестрикта

страница 4
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(12.11.2019)