Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

тельностей гомологичных таковым Е. coli. Вместе с тем очевидно, что экспрессия гетерологичных по таксономическому происхождению для этих клеток генов в не-

112

которых случаях происходит даже в отсутствии сигналов транскрипций характерных для Е. coli. Такое же заключение правомочно и для SD последовательностей, структура которых имеет отношение к экспрессии генов на уровне трансляции [324,348]. Эти выводы имеют прямое отношение к вопросу о влиянии барьера гетерологичной экспрессии на исход опытов по клонированию генов rm.

Влияние вторичной структуры иРНК генов rm на их экспрессию обсуждалось только в нескольких случаях [88, 206]. Наиболее подробно этот вопрос рассмотрен в случае иРНК рестриктазы EcoRV [88]. Оказалось, что за терминаторным кодоном в составе иРНК находится GC богатая область протяженностью в 110 нуклеотидов, содержащая несколько инвертированных повторов. Согласно расчетам их наличие позволяет образоваться нескольким стабильным двухспиральным структурам с одноцепочечной петлей, характерным для сигналов терминации транскрипции. Петля, входящая в состав одной из рассматриваемых структур, содержит последовательность из 7-ми нуклеотидов комплементарных с последовательностью, включающей и окружающей инициаторный кодон, что может привести к образованию дуплекса в этой области иРНК. Если предсказанная на основании расчетов структура действительно реализуется, то это могло бы привести к прекращению инициации трансляции сразу после синтеза полной последовательности иРНК- Таким образом трансляция могла бы осуществляться только в ходе транскрипции. Аналогичные структуры не выявлены в случае метилазной иРНК. Поэтому можно предположить, что в случае клонирования генов RMEcoR V этот механизм регуляции обеспечивает опережающую экспрессию метилазного гена.

В случае генов RMPst I отмечается наличие в составе иРНК, расположенных за терминаторным кодоном последовательностей, способных образовать шпилечные структуры [385]. Вопрос об их участии в регуляции экспрессии остается открытым.

В случае конвергентно ориентированных тесно сцепленных генов RMSin I, разделенных всего 31 нп, выдвинуто предположение о наличии в этой области общего терминатора транскрипции. Действительно такая последовательность, предположительно способная образовывать терминаторную шпилечную структуру с петлей, окруженная AT богатыми участками, в межгенной области имеется. Последовательности, способные давать шпилечные структуры в иРНК, имеются и за геном MBsuRI [206].

Анализ многих генов Е. coli показал, что они различаются по частоте использования синонимных кодонов [78,381]. Кроме того была выявлена корреляция между этим показателем и силой экспрессии генов, регулируемой на уровне трансляции. Обсуждаемый механизм регуляции обеспечивается таким обра-

8—5933 6

113

зом, что в сильно экспрессируемых генах кодонный состав коррелирует с наиболее представленными в количественном отношении в клетке изоакцепторными для отдельных аминокислот видами иРНК [78,381]. Синонимные кодоны, содержащие в третьем положении G/C, характерны для сильно экспрессируемых генов, обратная закономерность характерна для кодонов, содержащих в этом положении А/Т. AT состав ДНК влияет на кодонный состав [151].

AT состав ДНК Е. coli равняется 49% [88,148,277]. Этот показатель для генов RMEcoR I и RDEcoR V равняется 65% и 65,3% соответственно [88,148,277], что может быть связано или с особенностями организации этих локусов, определяющими уровень их экспрессии, или с их эволюционным происхождением из таксонов с таким AT содержанием. Высокое AT содержание характерно и для ряда других RM генов. Оно равняется 68,4% — RBsuR I, 61,9%—MBsuRI (AT содержание ДНК В. subtilis равно 57%) [206], 63% — RMDde I (43% — ДНК Desulfovibrio desulfuricans) [365], 62% — RPst I и 68% — MPst I [385]. Другие гены no AT составу не так сильно отличаются от характерного для Е. coli: 52% — RTaq I, 59% — MTaqI [3501, 58% — RMSin I [199]. Гены RMPaeR7 выделяются высоким GC содержанием, равным 60,8% (39,2% AT) [370].

Согласно кодонному составу гены RMEcoR I [148,277], EcoRV [88], PstRI [385] и BsuR I [206] могут быть отнесены к слабо экспрессирующимся в Е. coli. В случае RMTaq I [350] он соответствует распределению, характерному для ДНК этого микроорганизма. Выделяется в этом отношении структура генов RMPaeR7, кодонный состав которых соответствует таковому сильно экспрессируемых генов кишечной палочки [370].

9.3. Гомология генов, кодирующих ферменты рестрикции-модификации

Исследования, посвященные определению первичной структуры генов рестрикции-модификации с самого начала не являлись самоцелью. Полученные данные послужили предпосылкой для поиска возможных гомологии структуры генов — наличия или отсутствия консервативных нуклеотидных (или выводимых из них аминоскислотных) последовательностей. Эти сведения являются необходимыми для решения таких вопросов как эволюция генов rm, определение участков белковых молекул ответственных за специфическое взаимодействие с субстратом и участвующих в формировании каталитического центра.

Сравнение нуклеотидных или аминокислотных последовательностей производится с помощью компьютерной (см. обзоры [65,118]) техники. В этом направлении в настоящее время работы проводятся во многих лабораториях.

114

Первой была секвенирована система EcoRI [148,277]. Анализ последовательностей показал, что рестриктаза и метилаза существенно различаются на уровне первичной структуры, несмотря на то, что оба фермента взаимодействуют с одной и той же субстратной последовательностью. В дальнейшем оказалось, что это характерно и для остальных исследованных случаев [88,109,199,350,356,382]. Возможно анализ на уровне вторичной или третичной структур позволит обнаружить общие структурные элементы, однако, все же более вероятно, что отсутствие гомологии указывает на различную природу механизмов взаимодействия сопряженных рестриктаз и метилаз с субстратом.

Другим, может быть и менее неожиданным, результатом сравнения является отсутствие заметной гомологии среди рестриктаз [109,199,382], даже между ферментами с близкими характеристиками субстратной специфичности как, например, RPaeR7 I (5'С *TCGAG) и RTaq I (5'* TCGA) [350]. В то же время иммунологическими методами обнаружено сходство изошизомеров Rsr I и EcoR I на уровне третичной структуры [147]. К настоящему моменту также проведено определение 34 N-концевых аминокислот RRsr I и обнаружена значительная гомология с REcoR I. Данные по первичной структуре генов RMRsr I пока отсутствуют, что исключает возможность сравнения ее с этой характеристикой генов RMEcoR I.

В случае метилаз прослеживается иная картина. В результате систематических исследований бактериальных и фаговых метилаз, образующих т5С, разным авторам удалось выявить от трех до одиннадцати гомологичных районов, разделенных ва-риабильными участками [74, 109, 117, 147, 199, 217, 3561. Так, неотъемлемой частью этих ферментов являются аминокислотные фрагменты следующего состава: ENVK, Q—R—R, (D, N) — ----G—РС и др. Имеются э

страница 38
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.08.2019)