Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

оложительных, так и в грам-отрицательных микроорганизмах [119].

ДНК модифицирующую защитную функцию выполняет продукт гена dpnM. Функция второй метилазы, кодируемой геном dpnA не выяснена. Учитывая его перекрывание с эндо-нуклеазным и метилазным генами, для dpnM предполагается регуляторная роль на уровне трансляции или транскрипции [119].

Гены RMDpn II были успешно клонированы как в S. pneumoniae (гомологичный реципиент) [2211, так и в Е. coli [119]. Таким образом, эта система имеет элементы регуляции, проявляющие себя активно в клетках различной таксономической принадлежности.

Рассмотренными чатерьмя системами исчерпывается список исследованных генов rm, организованных тандемно таким образом, что локус метилазы предшествует локусу рестриктазы

(М-->-R-->¦). Такая организация, как уже отмечалось, может

явиться тем механизмом, который обеспечивает опережающую экспрессию метилазного гена. Наличие других вариантов организации обсуждаемых генов указывает на привлечение других способов контроля для обеспечения скоординированной их экспрессии. Особенная в этом необходимость должна обнаружиться в случае такого варианта тандемного расположения генов, когда г ген предшевствует m гену, так как следуя вышеизложенной логике, экспрессия гена рестриктазы может опередить таковую метилазы. Таких систем имеется три — RMEcoR I, Dde I и BsuR I (см. рис. 2).

Гены rm EcoRI [148,277], разделены 32 нп. Перед обоими из них выявлены промоторные и SD последовательности в той или иной мере гомологичные таковым характерным для Е. coli (см. табл. 21). Их взаимные расстояния и структура лучше соответствуют каноническим в случае промоторной области предшествующей метилазному гену. Эти данные указывают на, возможность раздельной транскрипции рассматриваемых локусов, а в случае метилазы и на более сильную экспрессию этого

ПО

гена. Действительно для метилазы (ген m следует за рестрик-тазным) этот вывод был подтвержден при изучении экспрессии раздельно клонированных гит генов [216,281]. Следует отметить, что сохранение клетками Е. coli, несущими экспресси-рующийся ген REcoR I, жизнеспособности в отсутствие модификации ДНК 1148,216], явилось неожиданным открытием, противоречившим всем имевшимся представлениям о неминуемой гибели r+m~ клеток.

Близкое взаимное расположение следующих друг за другом на расстоянии всего 6 нп и транскрибируемых в одну сторону генов RMDde I не исключает их котранскрипции с одного промотора [3651. Действительно характерные —35 и —10 структуры имеются только перед первым г геном. С другой стороны было показано, что делеционное удаление этих структур вместе с частью г гена не приводит к прекращению синтеза метилазы в клетках. Данные о том, что уровень экспрессии метилазного гена зависит от ориентации клонированного фрагмента ДНК (лишенного части г гена вместе с его промотором) могут быть приняты как указание на выполнение промоторной функции последовательностями векторной молекулы.

Гены RMDde I, несмотря на их тесное сцепление, не удалось проклонировать в один этап и пришлось это осуществлять в два приема — сначала перенести в реципиентные клетки ген метилазы, а затем на совместимой плазмиде — ген RDde I. Необходимость в этом была вызвана тем, что только определенным образом вырезанный метилазный ген, встроенный в векторную молекулу, смог обеспечить полную модификацию ДНК реципиентного штамма по Dde I сайтам. Неудача одно-этапного клонирования могла бы быть объяснена нескоорди-нированной экспрессией, выражающейся в первоочередной транскрипции (и соответственно экспрессии) рестриктазного гена, расположенного в начале оперона и обеспеченного, в отличие от метилазного гена, собственным промотором. Однако ситуация выглядит намного сложнее. Полное специфическое метилирование ДНК реципиентного штамма было достигнуто только в случае клонирования гена MDde I, лишенного с 5' конца промотора г гена и обрезанного, с 3' конца. Таким образом синтезируемый белок метилазы был лишен 33 концевых аминокислот, которые кроме того были замещены 6-ью аминокислотами кодируемых непосредственно прилегающей нуклеотидной последовательностью векторной молекулы pBR322. Это по каким-то причинам придало большую стабильность белку in vitro. Возможно это имеет место и in vivo.

Резюмируя обсуждение системы RMDde I следует отметить, что в данном случае ее скоординированное функционирование в новом хозяине не реализовалась. Обсуждая это явление, авторами публикации [180,365] выдвигается предположение, что причиной этому явлению может быть как дисрегуляция транс-

111

крипции генов rm или нестабильность иРНК, так и быстрая инактивация метилазы в клетках Е. coli протеазами.

В случае тандемно расположенных (R-->-М—-*-) генов

RMBsuR I однозначно доказана их раздельная транскрипция [206]. Этого и следовало ожидать, учитывая большое расстояние между ними (783 нп) и наличие элементов Прибнов бокса в —10 области перед каждым из генов (см. табл. 21). Анализ РНК транскриптов методом Si-картирования подтвердил выдвинутое предположение о том, что гены RMBsuR I считывают-ся с собственных промоторов.

Последовательность SD предшествующая инициаторному кодону гена метилазы BsuR I имеет большую гомологию с канонической по сравнению с таковой расположенной перед геном рестриктазы BsuR I. Расчеты показали, что сила взаимодействия SD участка с 3' концом 16S РНК в случае метилазы (расчетная свободная энергия—18,8 ккал/моль) значительно превышает этот показатель для нуклеазы (—9,4 ккал/моль). Возможно этот фактор оказался решающим в реализации опережающей экспрессии модифицирующего компонента при установлении клонированных генов RMBsuR I в Е. coli.

Для генов RMSin I характерно конвергентное расположение [199]. В этом случае очевидно, что транскрипция составляющих компонентов должна происходить с отдельных промоторов. В соответствии с этим перед обоими генами были обнаружены типичные —35 и —10 последовательности. Перед обоими структурными генами также имеются элементы SD последовательностей.

Дивергентная организация генов обнаружена в случае RMPst I и EcoRV (см. рис. 2). Они разделены 130 и 306 нуклео-тидными парами соответственно. В обоих случаях в общей области разделяющей составляющие гены наблюдаются типичные промоторные последовательности. Гены транскрибируются с разных промоторов и с разных цепей ДНК. В случае RMPst I было показано, что начало транскриптов разделяет всего лишь 70 нп. В связи с тем, что РНК полимераза Е. coli покрывает 40—50 нп начиная от точки инициацииiтранскрипции [385], не исключено перекрывание ею обоих промоторов. Экспериментально доказано, что in vitro полимераза имеет более сильное сродство к промотору метилазного гена. Сказанное предполагает преимущественную транскрипцию m гена и может объяснить тот факт, что, как установлено, этот ген экспрессируется более сильно, чем ген рестриктазы.

Резюмируя вышеизложенную информацию следует еще раз подчеркнуть, что ее интерпретация является однозначной в случае наличия или отсутствия сигналов инициации транскрипции и SD последова

страница 37
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.08.2019)