Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

щих ее уровень.

Данные представленные на рис. 2 убеждают в том, что гены системы rm значительно различаются по своей организации. Единственной общей чертой, выявленной среди охарактеризованных систем, оказалось тесное сцепление генов, которые могут располагаться во всех возможных вариантах, как в отношении их последовательности (rm, mr), так и во взаимной ориентации направления транскрипции (тандемная, конвергентная и дивергентная). Разнообразие организации генов rm могло бы указывать на разновариантность способа координации их экспрессии в разных системах rm. Наличие сведений о первичной структуре генов rm позволило приступить к анализу этого вопроса. Очевидно, что оперонная модель транскрипции блока генов rm может реализовываться только в случае их тандемного расположения. Таким образом организовано семь рассматриваемых систем (более половины среди исследованных) это гены PaeR7, Hha II, Taq I, EcoR I, Dde I, BsuR I и Dpn II (см. рис 2).

107

Оперонный вариант транскрипции предположительно имеет место в случае генов rm PaeR7 [143,370]. Этого и следовало ожидать, так как данные о первичной структуре свидетельствуют, что между генами метилазы и рестриктазы (расположенных в указанном порядке) не имеется никакого промежутка (сразу же за терминаторным кодоном ТАА в гене метилазы идет инициаторный кодон ATG гена рестриктазы). Расположение m гена перед г геном предполагает опережающую экспрессию первого. Кроме того наличие аналогов канонических —35 и —10 последовательностей наблюдается только перед геном метилазы. Делеционный анализ показал, что ступенчатое удаление 34 нуклеотидов в районе —35 области, расположенной в 5' направлении от точки инициации m гена, реализуется в постепенном скоординированном снижении экспрессии как проксимального (метилазного), так и, дистального (рестриктаз-ного) генов. Полное удаление —35 области приводит к полному прекращению синтеза метилазы и значительному (в 1000 раз) снижению уровня рестриктазы. Последний факт (наличие, хотя и слабого синтеза, рестриктазы) может быть объяснен выполнением очень слабой промоторной функции терминальной областью метилазного гена, хотя никаких аналогов —35 и —10 областей в ней не обнаружено. Здесь на расстоянии 5 нуклеотидов от инициаторного кодона гена-рестриктазы в частности выявлена последовательность 5'GGAG, частично перекрывающаяся с канонической для Е. coli SD последовательностью.

Количество рестриктазы PaeR7 в клетках значительно превышает таковое метилазы [370]. В связи с тем, что эти гены входят в состав оперона и предположительно котранскриби-руется уровень их экспрессии вряд ли контролируется механизмами транскрипции. Поэтому причину наблюдаемого явления следует искать в разнице эффективности трансляции сравниваемых генов. Действительно перед геном m не имеется последовательности SD, которая наблюдается на расстоянии 3—9 нп от инициаторного кодона гена эндонуклеазы. Кроме того не исключено, что наличие в составе метилазного гена редко используемого инициаторного кодона GTG, вместо обычного ATG, сказывается на эффективности трансляции соответствующей иРНК.

Анализ структуры генов RMPaeR7 указывает на возможность существования и других уровней контроля экспрессии, а именно на уровне использования кодонов. Согласно этому показателю гены RMPaeR7 близки к сильно экспрессируемым генам Е. coli.

Гены RMHha II, относящиеся согласно принципу их организации к тандемно расположенным в порядке М-->-R—-> разделены 21 нп [347]. Предположительно они могут образовать оперон. Элементы Прибнов бокса удалось обнаружить только перед метилазным геном ни перед одним из генов не имеется

108

элементов канонической для Е. coli —35 области. Показана зависимость одновременной экспрессии обоих генов от ориентации клонированного фрагмента, содержащего гены RMHha II, относительно векторных промоторов. Вместе с тем эти данные не противоречат предположению о функционировании генов RMHha II в Е. coli — в виде оперона. Реализуется ли в Н. haemolyticus — источнике генов, вопрос остается открытым. Относительно варианта реализации транскрипции генов

RMTaq I, расположенных в порядке М--»-R—>- на расстоянии

135 нп делать определенные выводы оказалось невозможным [3501. Перед ними не удается обнаружить последовательностей, характерных для промоторов Е. coli. SD последовательность обнаружена только перед г геном. Показано, что ген метилазы экспрессируется с векторных последовательностей, а последовательности необходимые для транскрипции гена рестриктазы расположены в метилазном гене. Поэтому в данном случае экспрессия этих генов в Е. coli скорее всего реализуется не с промоторов характерных для Т. aquaticus, продуцента RMTaq I. Относительно большое расстояние между этими генами позволяет предположить, что они в клетках Т. aquaticus транскрибируются раздельно.

В случае генов RMTaq I вопрос о скоординированной их экспрессии при клонировании в Е. coli, в отличие от подавляющего большинства других исследованных систем рестрикции-модификации, неожиданно оказался неактуальным. Клетки, содержащие рестриктазу остаются жизнеспособными и в отсутствие модифицирующего фермента.

Интересной особенностью обсуждаемой системы рестрикции^ модификации является неравномерное распределение Taq I сайтов между генами. В гене рестриктазы их имеется 7, а метилазы — ни одного, что является статистически достоверным отклонением от предсказуемого их распределения. Высказывается предположение, что такое расположение Taq I сайтов имеет какую-то регуляторную функцию. Возможный механизм такой регуляции мог бы заключаться во взаимодействии эидоиуклеазы с незащищенными метилированием Taq I сайтами в гене рестриктазы, что исключило бы его транскрипцию. Тем самым был бы прекращен синтез фермента до тех пор пока клеточная ДНК Т. aquaticus не подверглась бы модификации по всем незащищенным сайтам. Такой механизм мог бы играть определенную роль в ходе установления RMTaq I в новом хозяине и придал бы клеткам способность выживать в случае вариации степени метилирования ДНК-Исследование других клонированных генов rm показало, что аналогичное распределение узнаваемых сайтов является нехарактерным. Поэтому ауторестрикция не может явиться общим механизмом регуляции экспрессии генов рестриктазы.

109

Система RMDpn II отличается необычной для ферментов II типа генетической организацией [119,2211. Она включает 3 гена. Гены транскрибируются тандемно в следующем порядке: dpnM (метилазный), dpnA (метилазный) и dpnB (эндонукле-азный) (см. рис. 2). Кодирующие области первого и второго генов перекрываются на 8 нп, второго и третьего — на 11 нп. Характерные для —35 и —10 областей последовательности удается обнаружить только перед dpnM геном. SD последовательность, имеющая элементы гомологии с канонической для Е. coli имеется перед dpnB геном. Перед dpnM и dpnA продемонстрировано наличие типичных последовательностей, которые отличаются от структуры SD [1191. Их структура приведена н табл. 21. Предполагается, что они выполняют функцию SD последовательностей как в грамп

страница 36
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.08.2019)