Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

у генов rm между штаммами одного вида.

Вопросы регуляции экспрессии генов rm в первую очередь рассматриваются через призму того, каким образом обеспечивается скоординированный синтез рестриктазы и метилазьц исключающий возможность недометилирования ДНК. Опасность для выживания клетки могла бы возникнуть в случае отсутствия метилазной активности. Учитывая такие факты, как:

1) общепринятое мнение, что гены rm экспрессируются конститутивно;

2) для защиты ДНК от действия рестриктазы достаточно наличия модифицированного основания только в одной из цепей последовательности нуклеотидов узнаваемой рестриктазои (обычная ситуация наблюдаемая после репликации ДНК);

3) в клетках присутствуют системы, обеспечивающие-репарацию двухнитевых и однонитевых разрывов, маловероятно возникновение случаев самоубийства клетки собствен-

104

ной рестриктазой (за исключением случаев инактивации гена метилазы вследствии мутации). Совершенно другая ситуация имеется в случае клонирования генов rm или их установления в новом штамме в природных условиях. Предполагается, что опережающая экспрессия гена метилазы является необходимым условием для успешного одновременного клонирования гена сопряженной рестриктазы. Относительно большое число примеров клонирования генов rm в Е. coli служит указанием на то, что каким то образом это условие выполняется. Это тем более удивительно, так как большинство перенесенных в' кишечную палочку генов rm являются чужеродными (гетерологичными) по таксономическому происхождению реципиентному штамму. Вопрос о том, отражает ли это эволюционно закрепленную специфику генов rm или определяется случайными причинами, пока остается открытым. Мало что для обсуждения дают сведения о многочисленных примерах другого характера — неудачных опытах по клонированию генов rm, так как в этих случаях отрицательный результат может быть обусловлен многими причинами не связанными со скоординированным синтезом метилазы и рестриктазы.

Общепринято, что для успешного клонирования генов rm необходимо, чтобы они экспрессировались и экспрессировались скоординированно в том смысле, как этот вопрос обсуждается в контексте настоящего обзора. Рассмотрим данные служащие основой для рассуждений о том каким образом выполняются эти требования.

9.2.1. Структура регуляторных областей генов rm

Среди факторов способных влиять на уровень экспрессии генов rm рассматриваются — способ транскрипции (оперонный или для каждого из генов раздельный) структура последовательностей ДНК в 5' и 3' областях, окружающих структурные гены; GC состав структурных генов; частота использования кодонов, пространственная структура иРНК; наличие посттрансляционного процессинга.

Особенности промоторной области, прилегающей с 5' конца к структурным генам влияют на уровень экспрессии (транскрипции). У прокариотических микроорганизмов это так называемые —10 (Прибнов бокс) и —35 последовательности, определяющие силу взаимодействия с РНК полимер азой [324,3481. На уровень трансляции влияет последовательность SD (Шайн-Делгарно) [345], транскрипт которой составляет часть иРНК и определяет ее взаимодействие с 3' концом 16S РНК в рибосомах. В табл. 21 представлены данные о наличии и структуре этих, последовательностей в промоторных областях клонированных генов rm. Как видно наличие таких последовательностей в той или иной мере приближенных по структуре к

105

каноническим для Е. coli в ряде случаев наблюдается. Поэтому в этих случаях не возникает вопроса о механизмах экспрессии, которые могут быть реализованы соответствующими компонентами транскрипционного аппарата Е. coli. В остальных случаях перед структурными генами обсуждаемые последовательности частично или вообще не представлены (см. табл. 21), но это не препятствует их экспрессии. Это говорит об участии в регуляции транскрипции и (или) трансляции, либо последовательностей других, чем обсуждаемые, структур, либо транскрипции генов с промоторов расположенных в векторных

Таблица 21

Структура регуляторных областей генов rm

Ген

Область—35

Расстояние в парах нуклеотидов

Область—Ю

SD последова-т ельность

Расстояние до ATO в парах нуклеотидов

Литература

Е. coli" TTGACA 16-19 TATAAT TAAGGAGGTG 3-1

MPst I TTATTA 16 gATAcT

RPst I TTAAtA 23 TAgAgT

МНра II GAGG 13

RHha II GGAG 9

MEcoR I TTGAac 17 TATttT TAAGG 9

REcoR I GGANsGGA 3

MPaeR7 TTGcCg 13 TgTcATG

RPaeR7 GGAG 5

MTaq I

RTaq I TAAGGAGG 4

MDde I GGAG 9

RDde I TTGAct 15 TATAAT GGGG 5

MBsuR I TAagAT AGGAGG 10

RBsuR I TActAT GAGG 9

MecoR V TTGAgA 17 TATttT GGT 7

RecoR V TTGcaA 19 TAcAcT GGA 8

RMDpn 11

(M)dpnM TTGAtA 17 TAaAAT AATTTCTN 9

(M)dpnA TATA AATTTCTNs- 10

(R)dpnB TATA

GGAGG 6

RDpn I

(R)dpnC TTGoC 20 TtaAAT GGTG 11

(?)dpnD 17 AGGAN4ATC 7

MEcoR II TTcAat TAcAgT GGAGG 4

MBspR I TTGtCA 17 TAaAcT AAGG 9

RSin I TTGACt 22 TATAcT GGAGGT 4

MSin I TTGACt 17 cATAAT GGA 14

[348, 324 345]

[385] [347 [347 [148, 277( [148, 277Г [370] [370 [350 [350 [365 [365 [206 [206 [88] [88]

[119, 221]

[119]

[•119, 221]

[221] [221] [356] [298] Ц99] [199]

а —канонические структуры —35 и —10 областей, характерные для генов Е. coli приводится по [324, 348], a SD последовательности по [345].

106

молекулах. Последнее было подтверждено в случае генов RMHhaH, MTaqI и MBsp I [217, 347, 350], поэтому остается правомочным первое предположение.

Резюмируя рассмотренные данные напрашивается вывод о том, что уровень приближенности структуры промоторных областей генов rm к канонической для Е. coli не является единственным фактором, однозначно определяющим возможность экспрессии (как скоординированной, так и по принципу «да» или «нет») гетерологичных по происхождению генов (и тем самым успех клонирования генов rm). Конечно, не исключены случаи, когда этот фактор может явиться решающим.

9.2.2. Возможные механизмы скоординированной экспрессии генов гт

Отсутствие молекулярно-генетических препятствий для экспрессии клонированных генов, как уже отмечалось, не гарантирует успеха в таких экспериментах. Необходимым условием является реализация определенных механизмов, обеспечивающих опережающее по сравнению с рестриктазой действие метилазы на ДНК реципиентного штамма. Самым простым способом достижения этой цели могла бы быть опережающая экспрессия метилазного гена. Это может реализовываться или путем его опережающей транскрипции и (или) трансляции или какими то другими механизмами. В литературе отсутствуют генетические данные о существовании регуляторных генов контролирующих экспрессию генов rm II типа. Для генов rm предполагается конститутивная экспрессия. Однако, конститутивная их экспрессия не исключает возможности наличия механизмов контролирую

страница 35
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.11.2019)