Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

состав систем рестрикции — модификации. Метилаза Eco dam модифицирует аденин в последовательности 5'GATC. Ее ген локализован в хромосоме на 65 минуте, а ген метилазы Eco dcm (специфичность 5'CC(A/T)GG), локализован на 37 минуте [241]. Есть данные, что эти ферменты в бактериальной клетке выполняют полифункциональную роль [242, 330].

Следует отметить, что исследования систем RM II типа методами генанализа являются немногочисленными. Это вполне объяснимо, учитывая тот факт, что подавляющее большинство продуцентов рестриктаз относятся к таксонам, которые пока недоступны для применения генетических методов исследования. Поэтому в этом случае единственным выходом из создавшейся ситуации является применение молекулярно-генетического метода — метода генной инженерии. Учитывая большие потенциальные возможности этой методологии, в последнее время она стала основным подходом при исследовании таких вопросов как структура и структурная организация, а также регуляция экспрессии генов rm. Большой интерес представляют данные о первичной структуре, наличие которых способствует решению таких фундаментальных задач, как механизмы высокоспецифического белок-нуклеинового взаимодействия и эволюции генов рестрикции-модификации. В прикладном аспекте клонирование генов rm и исследование их структуры является базой для создания высокоэффективных продуцентов дефицитных ферментов.

9.1. Структура генов рестрикции-модификации

В настоящее время список клонированных систем RM (плюс RDpn I) насчитывает 48 наименований (см. разд. 5, часть II). Первичная структура установлена для 10-ти «классических» систем RM: EcoRI [148,277], EcoR V [88], Hha II [347], Pst I

101

1385J, PaeR7 [370], BsuR I [206], Ddel [365], Taq I [350], Dpn II [119,221], 5in I [199], рестриктазы Dpnl [221], узнающей и расщепляющей только метилированную ДНК, а также ряда метилаз [298,356]. Большое число клонированных генов позволяет предположить, что в ближайшее время число охарактеризованных в структурном отношении генов rm значительно пополнится.

На рис. 2 приведены данные о величине, взаимном расположении и направлении транскрипции генов рестрикции-модификации.

в*"*1-Tzk-- -тез-—

1728 1808

RrtI "-tt0-?—•

1521 378

PaeR7

Slnl

EcoRI Ddel Taj I ECORI HhaB

1593 738

513

* тз *вв

Bonn #** йрпА ^ 832 „804^ m -8 -y

Рис. 2. Организация генов rm (цифрами обозначены величины генов и расстояние между ними в нп)

Величины генов и соответственно кодируемых ими продуктов значительно варьирует: от 681 нп (RHha II) до 1728 нп (RBsuR I) для рестриктаз и от 513 нп (MHha II) до 1592 нп (MPaeR7) для метилаз. Во всех случаях, за исключением RMBsuR I и RMHha II, гены кодирующие рестриктазы, уступают по величине генам сопряженной метилазы.

Среди проанализированных систем RM имеются все возмож-

102

ные варианты транскрипции генов: дивергентной, конвергентной и однонаправленной (тандемной).

Все рассматриваемые системы характеризуются тестным сцеплением генов [ГШ—межгенный участок в большинстве случаев исчисляется несколькими (RMDde I) или десятками (RMEcoR I, RMHha II, RMTaq I) нуклеотидных пар. Выделяются в этом отношении гены RMBsuR I, расстояние между которыми равняется 783 нп. Другой крайний случай характерен для RMPaeR7, гены которой практически не разделены — сразу за терминирующим кодоном метилазного гена стоит инициирующий кодон рестриктазы.

Общепринято, что системы RM контролируются двумя генами. В этом отношении выделяются Dpn I и Dpn II. Последнюю систему кодируют три гена: dpn М (метилаза), dpn А (ме-тилаза) и dpn В (рестриктаза). Все три фермента узнают одну и ту же последовательность нуклеотидов 5'GATC. На основе имеющихся данных предполагается, что dpn М и dpn В соответствуют компонентам «классической» двухкомпонентной RM системы II типа [119, 221, 222]. Функция dnp А пока не установлена. В случае Dnp I в составе одного клонированного фрагмента находятся две рамки считывания отнесенные к генам dpn С и dpn D [221]. Первый из них кодирует ген>рестриктазы Dpn I, функция второго неизвестна. Вывод о том, что гены dpn С и dpn D являются взаимосвязанными в систему поддерживается данными о наличии с обоих сторон ДНК последовательностей гомологичных таковым, окружающим как целое систему генов dpn М, dpn А и dpn В [221,240]. Через эти последовательности путем рекомбинации происходит кассетное замещение одной группы генов на другую после трансформации ре-ципиентных клеток Streptococcus pneumoniae, содержащих одну из рассматриваемых Dpn систем донорной ДНК, несущей альтернативную по специфичности группу Dpn генов )[221]. Особенности организации Dpn II генов выражается кроме того и в перекрывании рамок считывания генов dpnA и dpnB (см. рис. 2) [119].

Возможно особенная организация системы Dpn не является единственным исключением. На это указывает тот факт, что и между генами RMBamH I также найден протяженный фрагмент с открытой рамкой считывания [97]. Функция гипотетического полипептида пока не определена.

Общепринято, что ферменты любой системы RM характеризуются идентичной специфичностью в отношении узнаваемой последовательности нуклеотидов. До последнего времени не имелось фактов противоречащих этому обобщению. Существуют гипотетические варианты метилазной специфичности, отличные от специфичности сопряженной рестриктазы, способные защищать клеточную ДНК. Возможно прообразом таких систем является REco47 I и МЕсо47 II узнающие перекрывающиеся

103

последовательности нуклеотидов — соответственно 5'GG(A/' /Т)СС и 5'GGNCC. Как видно из специфичности этих ферментов все сайты REco471 перекрываются с частью сайтов МЕсо47 II. О возможности отнесения этих ферментов к одной системе говорит тот факт, что согласно данным по клонированию соответствующие гены являются тесно сцепленными и ни в одном случае не удалось получить клонов несущих ген для МЕсо47 I [299].

9.2. Регуляция экспрессии генов рестрикции-модификации

Изучение регуляции экспрессии генов rm имеет свою специфику, выражающуюся в том, что, как уже отмечалось, исследуемая проблема в основном решается применением методов генной инженерии — клонирования соответствующих генов. Учитывая тот факт, что таксономическая принадлежность реци-пиентных штаммов (в подавляющем большинстве случаев штаммов Е. coli) и штаммов — источников донорной (клонируемой) ДНК зачастую отличается (см. разд. 5, часть II), экспрессия генов rm в таких случаях представляет вариант гетерологической экспрессии. Поэтому при интерпретации полученных результатов следует не упускать из виду, что формулируемые выводы относятся к регуляции экспрессии именно в новом для генов rm хозяине, а не к исходным клеткам (природном источнике клонированных генов). В связи с этим исследуемая проблема вынужденно во многом сводится к вопросам гетерологической, а учитывая специфику систем RM, и скоординированной экспрессии генов rm, что, понятно, не всегда отражает процессы происходящие в природном продуценте клонированных геиов. Эти замечания, очевидно, не относятся к перенос

страница 34
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.08.2019)