Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

мой последовательности [29].

Удаление одного или нескольких нуклеотидов одной цепи в левой от центра симметрии половине узнаваемого участка рестриктазы BamH I (б'ОЮАТСС) значительно снижает эффективность расщепления нативной цепи, так как видимо нарушается целостность двухспиральной структуры гидролизуемой половины сайта [45]. Эта рестриктаза отличается интересным поведением, которое выявили результаты эксперимента с синтетическим олигонуклеотидом dTCCAGATCTGGA, содержащим на концах половинки узнаваемого участка (выделено). Оказывается, RBamH I способна взаимодействовать с двумя дуплексными субстратами, стягивая их в единый комплеск, близкий по структуре к ковалентно связанным полинуклеотидным цепям. Другим примером такого поведения служит ДНК-лигаза фага Т4, способная к сшиванию двухцепочечных фрагментов ДНК с «тупыми» концами [131]. Молекула рестриктазы BabH I состоит из двух одинаковых субъединиц, в каждой из которых имеются связывающий и гидролитический центры [355]. Можно предположить, что связывающие центры в каждой из субъединиц взаимодействуют с «разъединенным» участком узнавания и соединяют его в структуру, подобную нативной, после чего вступает в действие гидролитический центр. Специфичность действия последнего существенно ниже специфичности связывания, так как гидролиз идет не только в каноническом месте (5'G43ATCC), но и рядом с ним. Такое расщепление может быть объяснено своеобразным люфтом между концами обеих молекул олигонуклеотидов, жестко не связаных ковалентными связями, а удерживаемых друг относительно друга за счет взаимодействия с ферментом, в котором, область межсубъединич-ного контакта может в определенных пределах деформироваться благодаря конформационной гибкости, свойственной всем белковым молекулам [20].

В рамках этого предположения показана допустимость пробелов в участке узнаваемом рестриктазой RBamH I, а именно — отсутствие аденина в одной или в обеих цепях, не исключающих его расщепления, [20].

Как следует из рассмотренной информации, в результате исследований взаимодействия рестриктаз с модифицированными субстратами накоплен большой экспериментальный материал, интерпретация которого зачастую отличается спекулятивностью и неоднозначностью.

Более прямым методом локализации специфических контактов аминокислотных остатков, участвующих во взаимодействии с ДНК, является фотохимическое сшивание белка с ана-

95-

логами ДНК, содержащими 5-бромурацил [102, 103]. Этот метод был использован [103] для установления участка связывания рестриктаз EcoR I и EcoR V с синтетическими олигонуклеотид-ными субстратами, содержащими указанную модификацию. В последние годы метод фотохимического сшивания ДНК с белком получил развитие, так как было показано [104, 128], что при использовании лазерного излучения происходит сшивание белка с немодифицированными основаниями ДНК. Однако, этот метод находится на стадии апробации и пока не может конкурировать с таким методом определения специфических контактов ДНК с белком, каким является рентгеноструктурный анализ — на сегодняшний день, самый информативный метод исследования тонкостей белок-нуклеинового узнавания.

8. РЕНТГЕНОСТРУКТУРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КОМПЛЕКСА РЕСТРИКТАЗЫ EcoRI С СУБСТРАТОМ

Наиболее полное представление о природе взаимодействия рестрикционных эндонуклеаз со специфической нуклеотиднои последовательностью было получено Розенбергом с сотр. [137, 250], которые впервые провели рентгеноструктурные исследования комплекса рестриктазы EcoR I с синтетическим 13-ти членным олигонуклеотидным дуплексом, содержащим последовательность 5'GAATTC, и имеющим следующее строение: 012345678 9 10 11 12 TpCpGpCpGpApApTpTpCpGpCpG (показана только одна цепь, участок узнавания рестриктазы EcoR I подчеркнут). В результате этих исследований была установлена трехмерная структура комплекса рестриктазы EcoR I с синтетическим олигонуклеотидом с разрешением в 3 А. Данные рентгеноструктурного анализа подтвердили модель симметричного узнавания [233] специфической нуклеотиднои последовательности рестриктазои EcoR I, а также предположения, полученные при исследованиях на модифицированных субстратах (см. разд. 7), о доминирующей роли взаимодействий в главном желобе ДНК в процессе узнавания специфической нуклеотиднои последовательности белком. В фермент-субстратном комплексе две субъединицы EcoR I образуют симметричную структуру, содержащую ДНК частично «погруженную» в белок с одной стороны между субъединицами, при этом главный желоб ДНК полностью контактирует с белком, а минорный желоб экспонирован в растворитель.

В результате рентгеноструктурных исследований были получены новые данные относительно структуры ДНК в комплексе с ферментом. Во-первых, было показано, что структура ДНК отклоняется от классической В-структуры ДНК. Установлено, что в комплексе с ферментом происходит частичное

96

расплетение спирали ДНК, относительно центральной пары оснований А6Т7 в олигонуклеотиде. В результате такого рас-плетения спирали ДНК происходит расширение главного желоба, что, по-видимому, облегчает доступ определенным участком белка для взаимодействия с основаниями ДНК. В результате частичного расплетения ДНК происходят не только изменения в остове ДНК, приводящие к изменению размеров главного желоба, но и изменения расстояний между соседними нуклеотидными основаниями. Установлено, что уменьшается расстояние между соседними нуклеотидными основаниями А5 и А6. Во-вторых, было показано, что наряду с частичным рас-плетением ДНК относительно центральной пары нуклеотидов А6Т7, происходит изгиб спирали в районе нуклеотида G4. Угол изгиба при этом составляет от 20° до 40°. Таким образом, было установлено, что при взаимодействии ДНК с EcoR I, происходят значительные изменения конформации ДНК.

В результате обсуждаемых исследований также была установлена трехмерная структура белка и выявлены структурные его детерминанты, взаимодействующие с ДНК. Каждая субъединица фермента представляет собой отдельный домен, состоящий из 5 р-структур, окруженных а-спиралями. Эти а-спирали ориентированы в пространстве таким образом, что их N-концы вклиниваются в главный желоб ДНК. Аминокислотные остатки, которые взаимодействуют с нуклеотидными основаниями, расположены именно на N-конце а-спиралей или рядом с ним. Первые 14 N-концевых аминокислотных остатка белка образуют петлю, которая «охватывает» ДНК в комплексе с ферментом.

Исследование структуры комплекса ДНК с EcoR I позволило также выявить возможную каталитическую щель, однако, расположение функциональных групп в активном центре белка установить не удалось, так как исследованный комплекс ДНК с EcoR I, образовавшийся в отсутствии ионов Mg2+, не является продуктивным. Расщепление фосфодиэфирной связи происходит лишь в присутствии Mg2+ и поэтому полная структура каталитического центра формируется в результате комплексообра-зования с этими ионами.

Несмотря на то, что проведенные исследования не позволили выявить структуру активного центра молекулы фермента, в результате все же был раскрыт механизм узнавания

страница 32
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(19.10.2019)