Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

фосфата, указывает на несущественность этой группы для взаимодействия субстрата с BamH I [419]. Увеличение скорости расщепления нативной цепи отражает участие нарушений структур ДНК, возникающих и при взаимодействии субстрата с рестриктазои, в обеспечении эффективного функционирования фермента [45].

Все представленные выше данные касаются фосфатов только сайта узнавания фермента, хотя имеются данные [127, 137, 233] о влиянии фосфатных групп и за его пределами на взаимодействие с рестриктазами. Это естественным образом вытекает из предыдущей части, где обсуждалась роль участков фланкирующих субстратные последовательности.

Следует отметить, что наличие негидролизуемых аналогов субстрата (с пирофосфатной, фосфоамидной связью и т. д.) позволяет не только исследовать требования к структурным элементам остова, но и изучить процесс образования фермент-субстратного комплекса в присутствии кофактора — ионов Mg2+ [10, 13]. Оказывается, что ионы Mg2+ требуются не только для гидролитического акта, но влияют и на процесс связывания субстрата.

7.3.2. Углеводный остаток

Вторичная структура ДНК играет важную роль в узнавании ферментами субстрата. Исследования коротких ДНК-дуплексов, содержащих участки узнавания ряда рестриктаз, методами ЯМР [333] и рентгеноструктурного анализа [137, 386] показали, что конформационные параметры отдельных нуклеотидных звеньев варьируют от значений, характерных для В-формы до значений, присущих А-форме двойной спирали. Известно, что некоторые ферменты взаимодействуют с ДНК в различных формах. Например, рестриктазы BssH II и BamH I не расщепляют субстраты в Z-форме [67].

На примере модификации углеводных остатков участка

92

узнавания, изменяющих вторичную структуру ДНК, была сделана попытка рассмотреть влияние этого фактора на взаимодействие с ферментами.

Согласно данным Виноградовой с соавт. [12], введение рибо-уридина (rU) в участок узнавания рестриктаз-изошизомеров EcoR II и Mva I (5'СС(A/TJGG) и Sso II (5'CCNGG) вместо dT, сопровождается локальным искажением В-формы двойной спирали, обусловленным появлением домена с конформацией подобной А-форме. Такая замена вызывает замедление ферментативной реакции катализируемой EcoR II. В случае Sso II [11] наблюдается обратный эффект — ускорение расщепления модифицированного субстрата. Возможно, в комплексе Sso II с на-тивным субстратом конформация вырожденной пары (А/Т) участка узнавая соответствует А-форме двойной спирали.

Может возникнуть вопрос — не обусловлено ли замедление скорости гидролиза rU-субстрата рестриктазой EcoR II отсутствием 5-метильной группы тимина в нем. Это исключается, поскольку при замене dT на dU скорость реакции уменьшается только в 2 раза [410], а в обсуждаемом случае она снизилась в 10 раз.

Для рестриктазы Mva I эта модификация, а следовательно и искажение формы спирали узнаваемого участка, не влияет на расщепление Т цепи, а интактная — А цепь расщепляется лишь незначительно хуже, что обясняется важностью контактов для одной субъединицы фермента не только со своей, но и с противоположной цепью [29].

Отношение рестриктазы EcoR I (5'GAATTC) к модификациям углеводных остатков было исследовано путем введения вместо внешнего dA в участке узнавания 9-(3-0-арабинозиладенина (аА), аденозина (гА), 2'-дезокси-2'-фтораденозин (ИА), а вместо dG-2'-Ae30KCH-2 -фторгуанозина (HG). Все перечисленные модификации за одним исключением ингибировали расщепление ферментом соответствующих дуплексов. Исключение относится к flG замене, которая дала увеличение скорости гидролиза [282]. Изменение скорости ферментативной реакции опять можно объяснить появлением доменов А-формы обусловленных наличием rA, ПА, аА [283], flG [282], в которых углеводный остаток аденозина или гуанозина находится в З'-эндо форме, в отличие от 2'-эндо формы, присущей дезоксиаденозину или дезоксигуанозину. Делается предположение, что замена G на flG благоприятствует фермент-субстратному взаимодействию [282].

Как видно, для активности большинства рестриктаз требуется правильная В-форма ДНК. Любое искажение ее структуры приводит к изменению активности ферментов, на что например, указывает отсутствие расщепления рестриктазой EcoR I рибооктамера 5'GGAAUUCC, которому присуща А-форма [282].

93

7.4. Некоторые взаимодействия рестиктаз с отдельным нуклеотидом (или его звеном) участка узнавания

Каждый нуклеотид участка, узнаваемого соответствующей рестриктазои, играет свою и только ему присущую роль в обеспечении эффективного взаимодействия фермента с ДНК и ее расщепления. Были проведены эксперименты с целью установить функцию отдельного нуклеотида (dNp) или всего звена (pdNp) участка узнавания способом его удаления (с сохранением или отсутствием ковалентной непрерывности фосфодиэфирной связи) [20, 30, 45] или замены на другой нуклеотид, содержащий некомплементарное основание [233], в вышеуказанных процессах.

Например, замена центральной пары оснований участка узнавания рестриктаз EcoR II, Mva I и Sso II (5'CC(T/A)GG) AT на AA или ТТ вызывает замедление реакций катализируемой EcoR II [408] и Sso II [29] (особенно в случае замены на АА пару) и полное блокирование (при замене на АА) гидролиза измененного субстрата рестриктазои Mva I [29]. Изменение в скорости гидролиза возможно из-за локального искажения конфигурации двойной спирали участка узнавания, которое наблюдается с появлением некомплементарной пары оснований. Этот эффект выражен сильнее в случае контакта двух относительно больших остатков аденина. То же наблюдается и при замене внутренней пары CG на GG в участке узнаваемом Mva I [29] — модифицированная цепь не гидролизуется, а интактная — расщепляется с низкой эффективностью.

Модификация участка, узнаваемого этими же ферментами, состоящая в исключении dA или dT звена с нарушением или сохранением в цепи непрерывности фосфодиэфирных связей приводит к полному ингибированию расщепления обеих цепей рестриктазами Mva I и EcoR II [30]. Таким образом, наличие не-модифицированного центрального нуклеотидного звена pdTp или pdAp в каждой из цепей участка, узнаваемого EcoR II, необходимо для продуктивного взаимодействия фермента с субстратом. Основываясь на данных предыдущего раздела о роли фосфатных групп узнаваемого участка рестриктазы Mva I, более точно определяется звено, имеющее существенное влияние при взаимодействии эндонуклеазы с ДНК — это не pdAp или pdTp, a dAp или dTp. Обе упомянутые рестриктазы имеют контакт с остатком dA участка узнавания, который реализуется для различных целей — RMva I его использует только для расщепления А цепи, a EcoR II — для гидролиза обеих цепей [29]. Этот вывод делается на основе данных о действии RMva I и EcoR II на субстраты, в которых звено dA заменено на триметиленовый мостик. В случае REcoR II гидролиз отсутствует, а в случае RMva I, немодифицированная Т цепь расщеп-

94

ляется довольно эффективно, а модифицированная — лишь не-значительно.

Для полноты характеристики этих рестриктаз надо отметить, .что в отличие от EcoR II, Mva I отличает аденин от тимина в узнавае

страница 31
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.09.2019)