Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

ых остатков, хотя имеют обычную таутомерную форму. Таким образом, ингибирование расщепления субстрата, содержащего АА пару, вызвано прежде всего конформационным фактором. Замена на АС пару вносит в ДНК еще более существенные искажения, чем АА пара. Хотя гетероциклические основания пары А имеют обычную конформацию и таутомерную форму, они, возможно, выходят за пределы двойной спирали. Соответственно, большее нарушение структуры ДНК (замена на АС пару) соответствует более сильному замедлению (60 раз) расщепления субстрата рестриктазой EcoR II по сравнению с нативным дуплексом (при замене на АА пару гидролиз замедляется в 10 раз) [372]. Как видно, для эффективного действия фермента необходимо наличие правильной структуры нуклеотидной пары, примыкающей к сайту узнавания. Наблюдаемая чувствительность рестриктазы EcoR II к структурным аномалиям во фланирующей последовательности может быть следствием как изменения самой этой последовательности, так и передачи структурного изменения в участок узнавания [12].

В случае рестриктазы EcoR I введение даже двух АС пар рядом с участком узнавания не приводит к столь сильному как в случае EcoR II замедлению гидролиза (только в 3 раза). Расщепление ускоряется, если у сайта расположены AT пары оснований и ингибируется — если пары CG [224]. Эта рестриктаза удовлетворяется минимальным числом нуклеотидов (одним), примыкающим к участку узнавания, а для рест-

89

риктазы Hind III необходимы два витка спирали [4]. Kpn I требует фланкирования обеих цепей с 5'-конца и хотя бы одной цепи с З'-конца [3].

Обнаружено, что рестриктаза Msp I расщепляет быстрее цепи богатые пуринами. Это объясняется предположением, что пуриновые нуклеотиды создают гидрофобное окружение, важное для полноценного взаимодействия с рестриктазои, или предопределяют молекулярную структуру участка узнавания через «стэкинг» взаимодействие оснований [411]. Рестриктаза Нра I расщепляет преимущественно цепи находящиеся в пири-мидиновом окружении (в 3—4 раза быстрее, чем в пуриновом), а Мпо I не делает предпочтения ни для одного типа окружения цепей [73].

Обобщая можно сказать, что последовательности нуклеотидов, окружающие участки узнавания, через свою гидрофобность или гидрофильность или своим пространственным расположением может влиять на формирование фермент-субстратного комплекса, в котором происходит разрыв фосфодиэфирной связи.

7.3. Взаимодействие рестриктаз с углеводфосфатным остовом участка узнавания

Известно, что углеводфосфатный остов во многом определяет конформацию и физико-химические свойства нуклеиновых кислот. Естественно ожидать, что удаление или замена отдельных структурных элементов углеводного остова будет приводить к измененной конформационной подвижности его химических группировок и тем самым нарушать каноническую конформацию нуклеотиднои последовательности. Таким образом, осуществляя модификации остова, можно оценить взаимосвязь между конформацией ДНК и функционированием рестриктаз. С целью выявления значимости отдельных структурных элементов углеводфосфатного остова участка узнавания были изучены субстратные свойства олигодуплексов с модифицированными фосфодиэфирными связями в виде разрыва фосфодиэфирных связей [30, 407]; 2) или отсутствия фосфатной группы [30, 408, 419] в олигонуклеотидной цепи, а также с модифицированным углеводным остатком [12, 282].

7.3.1. Фосфатные группы

Электростатические контакты рестриктаз BamH I, EcoR I и некоторых других ферментов с фосфатными группами участка узнавания играют существенную роль в фермент-субстратном взаимодействии [396]. Этот вывод подтверждается обнаружением в активных центрах ферментов положительно заряженных аминокислотных остатков лизина и аргинина.

90

В литературе довольно подробно исследовано взаимодействие рестриктаз EcoR II, Mval, BamHI и SsoII с фосфатными группами участка узнавания. Их функция изучалась при помощи олигонуклеотидов в которых фосфодиэфирная связь разорвана, фосфатная группа отсутствует или она же заменена на негидролизуемые фосфоамидную [10, 19, 42, 407], пирофос-фатную [29, 407, 419] и метилфосфатную группировку [45] или этилендиаминовый фрагмент [29].

Замена гидролизуемой фосфодиэфирной связи на фосфоамидную (в случае REcoR II) и пирофосфатную (в случае RMval) приводит к полному блокированию расщепления модифицированной цепи гетеродуплекса указанными выше ферментами [29].

Фосфатная группа Т цепи (5'+CCpTGG) важна для формирования контакта с рестриктазами EcoRII и SsoII, на что указывает отсутствие расщепления обеих цепей субстрата с введенной в это положение пирофосфатной связи, а также этилен-диаминовой вставки [29]. В случае рестриктазы Mva I блокируется расщепление только модифицированной цепи, что позволяет делать вывод о том, что для рестриктаз EcoR II и Sso II [29, 30, 407] эта фосфодиэфирная связь более важна, чем для RMva I.

Роль фосфатной группы А цепи (5'+CCpAGG) во взаимодействии с EcoR II изучалась также путем сопоставления данных гидролиза субстрата, содержащего разорванную фосфодиэфир-ную связь в указанном положении и субстрата с удаленной фосфатной группой [30].

Реакция гидролиза первого олигодуплекса отличалась сильным замедлением скорости расщепления немодифицированной Т-цепи и полным блокированием гидролиза А-цепи. Близкая картина наблюдалась и в том случае, когда фосфатная группа была удалена с места разрыва. Следует также отметить, что упомянутые модификации сопровождаются искажением вторичной структуры участка узнаваемого эндонуклеазой, (из-за увеличения конформационной подвижности групп атомов, находящихся вблизи разрыва), что вероятно и вызывает очень сильное ингибирование реакции расщепления цепей. Можно предположить, что дефект структуры в узле —Т—G— приводит к нару-

—АрС—

шению специфических белок-нуклеиновых контактов с А-цепью. В итоге экспериментов с указанными выше двумя субстратами делается вывод о том, что рестриктаза EcoR II не имеет контакта с фосфатом (5'CCpAGG) А-цепи, а наблюдаемые эффекты объясняются конформационными изменениями субстрата [30].

Фредерих и др. [137] при исследовании комплекса рестриктазы EcoR I с олигонуклеотидом методом рентгеноструктуриого анализа обнаружили отклонение от В-формы ДНК, а именно установили, что в области участка узнавания происходит рас-

91

ширение основного желоба ДНК, а в прилегающих к сайту последовательностях появляются А-подобные структуры двойной спирали. Предполагается, что фермент таким образом стабилизирует переходное состояние, в котором расщепляемая фос-фодиэфирная связь имеет повышенную мобильность. В случае EcoR I обнаружен изгиб между GAA и ТСС [137] участка узнавания (5'GAATTC). Возможно тоже самое происходит и в случае BamH I (5'GGATCC), так как отсутствие в одной цепи фосфатной группы между А и Т, приводящее к разрыву остова, сильно ускоряет гидролиз нативной цепи [45]. Ускорение гидролиза также наблюдается и при отсутствии в одной цепи меж-нуклеотидного фосфата между А и G. Этот эффект, а также аналогичный ему в случае метилфосфатной модификации этого же

страница 30
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(14.11.2019)