Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

бобщая полученные результаты чувствительности рестриктаз к т4С и т5С можно сказать, что ферменты могут дифференцировать оба положения и проявлять различную чувствительность к соответствующим основаниям. Объяснение этому можно искать, анализируя расположение этих метильных групп в двойной спирали ДНК. По этому признаку метилирование ^-положения существенно отличается от такого по С5. Хотя обе метальные группы находятся в большом желобе В-ДНК, №-метильная группа находится в центральной, т. е. наиболее выступающей части желоба, а С5 — в боковой. В дополнение, метилирование цитозина по Ы4-положению создает не только стерические затруднения при взаимодействии с ферментами, что возможно имеет место и в случае С5-метилирования, но также блокирует ЫНг-группу — важный контакт опознавания С : G пары, находящийся в большом желобе ДНК.

86

Следует отметить, что т4С в отличие от т5С в составе дуплексов дестабилизирует двойную спираль ДНК [104].

Вероятно, что рассмотренные выше различия в основном и обуславливают более сильный ингибирующий эффект Ы4-метил-цитозина в отношении действия ферментов.

Результаты рассмотренных экспериментов свидетельствуют что 4-NH2 группа цитозинов в участке узнавания соответствующих ферментов играет важную роль во взаимодействии. Наблюдаемое снижение скорости или отсутствие расщепления, если в это положение введена СН3-группа, свидетельствует о потере способности 4-NH2 участвовать в образовании водородной связи с белком, или о стерическом препятствовании СН3-группы сближению модифицированного субстрата с ферментом или гидролизу олигонуклеотида.

7.1.4. Гуанин

Наиболее исследованными точками контакта гуанина [146] с ферментами являются 2-аминогруппа (2-NH2) (малый желоб) и атом азота в положении 7 (7N) (большой желоб).

Значение 2-NH2 группы гуанина исследовано путем ее метилирования [285] или ее удаления путем замены G на гипоксантин (I) [29,90,127,285]. Последний путь применяется наиболее часто. Изучено взаимодействие рестриктаз EcoR I [90], EcoR II [29], Bgl II [285], Нра I [127], Sau3A I [285], Mbol [285], Mva I [29] с модифицированными таким образом синтетическими субстратами.

Установлено, что для активности рестриктаз EcoR I (5'GAATTC) [90], EcoR II (5'CC(A/T)GG) [29], Mbo I (5'GATC) [285], Mva I (5'CC(A/T)GG) ![29] 2-NH2 группа не является обязательной, так как скорость гидролиза модифицированного ДНК-фрагмента практически не снижается. В случае EcoR II и Mva I имеются данные о гуанине, соседнем с центральным тимином. Данные о значимости правого крайнего гуанина участка узнавания этих рестриктаз отсутствуют. Исследование влияния модификаций по 7-N положению G, показали что все рассмотренные выше рестриктазы являются чувствительными к ним.

Ряд рестриктаз Hpal (5'GTTAAC) [127], Bgl II (5'AGATCT) и Sau3A I (5'GATC) [285] требуют контакта' (или сближения) с 2-NH2 группой для акта связывания и (или) расщепления. Подтверждением этому служит отсутствие расщепления соответствующих модифицированных субстратов. Из этих данных следует вывод, что для этих ферментов контакты с малым желобом ДНК играют важную роль.

Спектры КД и кривые Тш додекануклеотидов, содержащих метальную группу в 2-NH2 положении гуанина указывают на то, что СН3-группа увеличивает Тт дуплекса, тем самым стабили-

87

зируя форму ДНК. Возможно, она усиливает «стэкинг» взаимодействие гуаниновых оснований [285]. Удаление 2-NH2 группы из малого желоба вызывает изменения в коиформации ДНК [90, 137]. Логично ожидать, что все эти замены, связанные с влиянием на конформацию ДНК, могут снижать или даже блокировать расщепление субстрата рестриктазами.

Акцептор протонов 7N положение гуанина (большой желоб) является точкой контакта для рестриктазы EcoR I [137], которая очень слабо гидролизует ДНК-фрагмент, если произведена замена гуанина узнаваемого участка на 7-деазагуанин [336].

Завершая обсуждение роли отдельных групп атомов гетероциклических оснований в специфическом взаимодействии рестриктаз с субстратом следует еще раз отметить, что обычно результаты об изменении их активности (или полном ее отсутствии) вследствие введения в основание дополнительных химических групп или при их удалении, интерпретируются как указание на близкое расположение или взаимодействие фермента с соответствующей группой во время реакции. Кроме того, для получения более достоверной картины, следует учитывать влияние модификаций субстрата на конформационные изменения ДНК, а также на превращения, которые могут быть необходимыми для прочного связывания ферментов и для катализа реакции расщепления.

7.2. Влияние нуклеотидных последовательностей, фланкирующих участок узнавания

Как уже отмечалось, рестриктазы взаимодействуют не только с сайтами узнавания, но и с прилегающими участками. Существуют определенные требования к фланкирующим последовательностям (длина и природа) для обеспечения эффективного взаимодействия. Надо отметить, что эти требования индивидуализированы для разных рестриктаз [3, 4, 12, 73, 224, 407, 408, 411]. С целью их выяснения синтезируются олигонуклеотиды, содержащие участок узнавания соответствующей рестриктазы, но с различным его окружением, т. е. различается длина или природа прилегающих нуклеотидных последовательностей. Это позволяет сравнительно легко оценить требования рестриктазы, предъявляемые к субстрату, выполнение которых необходимо для реализации полноценного взаимодействия.

В ранних работах отмечалась устойчивость синтетических олигонуклеотидов, содержащих изолированные участки узнаваемые рядом рестриктаз (EcoR I, Hind III, BamH I), к соответствующему ферменту [4, 146]. В случае рестриктазы EcoR I это было объяснено низкой устойчивостью AT богатого дуплекса 5'GAATTC [146], однако, этому выводу противоречит способ-3'CTTAAG

88

ность EcoR I расщеплять более длинные олигонуклеотнды, содержащие ту же последовательность и образующие еще менее устойчивые шестинуклеотидные дуплексы с «липкими» концами [4]. Вероятно рестриктазы способны стабилизировать, а затем расщеплять даже малоустойчивые дуплексы. Устойчивость к действию рестриктаз как изолированных сайтов узнавания, так и некоторых других олигонуклеотидов, содержащих участки узнавания, в первую очередь объясняются тем, что они не удовлетворяют определенным структурным требованиям [3].

Установлено, что для успешного гидролиза олигонуклеотида рестриктазой EcoR II недостаточно окружения из двух нуклеотидов с обеих сторон участка узнавания [407]. Для этого требуется ДНК фрагмент длиной 23—32 пар оснований [10, 409]. Введение в прилегающую последовательность некомплементарной пары АА или АС вместо пары AT, приводит к ингибирова-нию расщепления субстрата. Изучая структуру олигонуклеотидов, содержащих пару АА [372], методом ЯМР было установлено, что она находится внутри двойной спирали, хотя «стэкинг» — взаимодействие этой пары с соседними частично нарушено и конформация углеводфосфатного остова также изменена. Остатки гетероциклических оснований некомплементарной пары находятся в анти-ориентации относительно дезок-сирибозн

страница 29
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.09.2019)