Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

не имеет контакта с 5-СНз группой центрального тимина. Замещение ее на Н или F атомы [215] не влияет на расщепление. Замена на атом брома [29] снижает скорость расщепления ДНК-дуплекса в 1,5 раза, по сравнению с немодифицированным. Ингибирующий эф-

83

фект, по-видимому, является результатом стерических препятствий атома брома, расположенного рядом с местом расщепления.

7.1.3. Цитозин

С целью выявления возможных контактов эндонуклеаз рестрикции с атомом водорода в С5-положении цитозина (расположен в большом желобе ДНК) изучалось их взаимодействие с субстратами, содержащими метальную группу (ш5С) [12, 19, 90, 136, 284, 377] или атом брома — 5ВгС — [19] в участках узнавания.

Недавнее открытие нового варианта метилированного С — т4С (цитозин метилирован по 4-амино группе (4-NH2) [103, 128] стимулировало появление работ, посвященных выяснению роли 4-NH2 группы цитозина, находящейся как и т5С в большом желобе, на взаимодействие ферментов с ДНК.

Относительно рестриктазы EcoR I (5'GAATTC) имеются противоречивые данные о роли 5-Н атома во взаимодействии фермента с ДНК-дуплексами. Одни исследователи делают вывод о том, что он че играет никакой роли (скорость расщепления субстрата, содержащего т5С, не меняется, по сравнению с каноническим) [377]. Бренан и др. [90] получили противоположный результат (EcoR I не расщепляет олигонуклеотиды, в которых цитозин заменен на ш5С или 5ВгС) и объясняют его тем, что фермент находится в непосредственной близости с С5 атомом углерода. Отсутствие расщепления таких субстратов объясняется интерференцией этих групп взаимодействию рестриктазы с группами и атомами соседних оснований, а также изменением коиформации ДНК в участке узнавания. По поводу второго предположения имеются подтверждающие данные рентгеноструктурного исследования кристалла самокомплементарного додекануклеотида, содержащего т5С и 5ВгС в участке узнавания EcoRI [136]. Возможно, что то же самое происходит и со структурой модифицированного субстрата в растворе.

Исследователи [12, 19] предполагают, что рестриктаза EcoR II (5'СС (А/Т) GG) имеет контакты (или сближение) с 5-Н атомами обеих цитозинов в цепи содержащей Т, и внутреннего цитозина в цепи, содержащей А. Этот вывод является следствием результатов гидролиза замещенных по этим положениям 5-метил-и 5-бромцитозин субстратов. Полное ингибирование или резкое замедление расщепления этих ДНК-Дуплексов объясняется, (в случае модификации внутренних цитозинов обеих цепей), исключительно стерическим эффектом метильной группы (кова-лентный радиус в 2 раза превышает радиус водорода, а Ван-дер-ваальсовый радиус—в 1,7 раза), а в случае 5'-концевого цитозина цепи содержащей Т, — образованием непродуктивного комплекса [410]. Кинетические параметры показывают, что он

84

отличается большой прочностью и высоким значением То,5 (период полураспада комплекса). Как видно, это не является достаточным условием для успешного протекания ферментативной реакции.

Рестриктаза Mval (5'CC(A/T)GG) нечувствительна к модификации С5 положения обоих цитозинов в своем сайте [19, 215]. Замена С в одной или в обеих цепях на т5С не влияет на скорость расщепления модифицированного субстрата, а значения Км для Т- и А-цепей такого дуплекса почти не отличаются от Км этих же цепей канонического дуплекса, что указывает на беспрепятственное формирование фермент-субстратного комплекса [215]. Все это свидетельствует об отсутствии непосредственных контактов рестриктазы Mva I с 5-Н атомом обоих цитозинов в участке узнавания [29].

Получены данные, что как EcoR II, так и Mva I (изошизоме-ры узнающие 5'CC(A/T)GG) не расщепляют субстратов, в которых метилирована экзоциклическая NH2 группа внутреннего цитозина [ЮЗ]. Также установлено, что метилирование экзоцик-лической аминогруппы 5'-концевого цитозина препятствует расщеплению модифицированной цепи гемиметилированного ДНК-дуплекса рестриктазой Mval (5'СС(А/Т)GG), а немодифицированная цель расщепляется достаточно эффективно [29]. Значит, для этого фермента наличие контакта с 4-NH2 группой внешнего цитозина в одной из цепей субстрата необходимо для расщепления только этой цепи ДНК-дуплекса, а гидролиз другой цепи протекает независимо от наличия или отсутствия этого контакта.

В аналогичных экспериментах было показано, что эндонук-леаза EcoR II и меет контакты с экзоциклическими аминогруппами 5'-концевых цитозинов в обеих цепях, так как введение т4С в одну из цепей блокировало расщепление обеих цепей [29].

В случае рестриктаз AIu I (5'AGCT), Pvu II (5'CAGCTG) и Cfr61 (5'CAGCTG) было установлено, что замена цитозина в составе 5'AGCT на mSC или т4С исключало расщепление субстратов указанными ферментами [102].

Рестриктазы Bgl II (5'AGATCT), Sau3A I (5'GATC), Mbol (5'GATC), Mfll (5'PuGATCPy) не расщепляют гомодуплексы, содержащие m5C (в составе 5'GATC) в участках узнавания соответствующих ферментов [284]. Bgl II и Sau3AI также не гид-ролизуют ни одной цепи гетеродуплекса, содержащего это основание. Рестриктазы Mbo I и Mfl I расщепляли обе цепи, но с различной скоростью. Mbo I расщепляла быстрее немодифици-рованную, a Mfl I — модифицированную цепь. Это указывает на расщепление дуплекса способом, в котором рестриктаза связывается с одной цепью, а расщепляет другую. Как видно, реет-, риктазы Bgl I и Sau3A I имеют тесные контакты с 5Н атомами

85

цитозинов своего участка узнавания, а для Mbo I и Mfl I эти контакты не являются необходимыми.

Расщепление субстратов рестриктазами Bgl II, Sau3AI, Mbo I, Mfl I блокировалось и при введении метильной группы в N''-положение (как и в случае С5-метилирования цитозина) [284]. Метилирование аминогруппы цитозина в одной цепи гетеродуплекса полностью ингибировало расщепление этой же цепи рестриктазами Bgl II, Sau3AI и обнаруживалось только следовое расщепление немодифицированной цепи. Рестриктазы Mbo I и Mfl I расщепляли обе цепи субстрата, только с различными скоростями (это указывает на способ расщепления, обсужденный выше).

Интересными свойствами обладает рестриктаза Msp I (5'CCGG). Ее действие блокируется введением метильной группы в С5 положение наружных цитозинов узнаваемого участка [105]. Однако она, хотя и замедленно, расщепляла субстраты содержащие в этом положении т4С. Изучение взаимодействия RMsp I с гемиметилированным субстратом показало, что в гете-родуплексе m5CCGG : CCGG модифицированная цепь расщепляется более эффективно. То же самое было отмечено и в случае гетеродуплекса m4CCGG: CCGG. В этом отношении RMsp I напоминает рассмотренные выше RMbo I и Mfl I.

С целью изучения чувствительности RM ферментов к разным вариантам модификации цитозина на примере рестриктаз Msp I (5'CCGG), Нра II (5'CCGG), Sma I (5'CCCGGG), Xma I (5'CCCGGG), Cfr9 I (5'CCCGGG) было проведено систематическое исследование влияния метилирования цитозинов, расположенных в разных местах узнаваемого участка, по С5 положению или 4ЫНг группе [105]. Было установлено, что т4С, как правило блокирует действие большинства исследованных ферментов. Ингибирующий эффект т5С выражен значительно слабее.

О

страница 28
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(19.10.2019)