водородную связь с 2-оксигруппой тимина. Для контроля в то же самое положение сайта вводили 2,6-диаминопурин (2,6 АР). Эта замена возвращает 6-NH2 группу в большой желоб с сохранением 2-NH2 группы в малом желобе. Оба олигонуклеотида расщеплялись ферментом (хотя и незначительно), из чего следует, что отсутствие 6-NH2 группы аденина в большом желобе (участвующей, как отмечалось, в образовании водородной связи с остатком глутаминовой кислоты в ферменте) не исключает специфического узнавания субстрата рестриктазой EcoR I и его расщепления. Видимо, отсутствие обычной водородной связи компенсируется благодаря взаимодействию фермента с другими группами участка узнавания [322]. Введение дополнительной метильной группы в любой аденин участка нежелательно, так как это препятствует взаимодействию и полностью блокирует катализ [90] — это обсуждалось выше и объяснялось стерическими эффектами этой группы.

Роль 7-N атома обоих аденинов в узнаваемом участке рестриктазы EcoRI (5'GAATTC), Сила и др. [337] определяли путем синтеза олигонуклеотидов, содержащих 2'-дезокситу-берицидин (отсутствует 7-N атом аденина) в разных положениях сайта узнавания. При замещении одного из нуклеотидов, образовались ожидаемые продукты реакции, хотя рестрикция была сильно замедлена. Замещение сразу обоих нуклеотидов приводило к ингибированию расщепления рестриктазой EcoR I.

Результаты рентгеноструктуриого изучения кокристалла EcoRI — олигонуклеотид [137], указывают на участие 7-N атома обоих аденинов во взаимодействии в качестве акцепторов протонов соответствующего аминокислотного остатка фермента. Из этого авторы делают вывод о том, что фермент может приспособиться к отсутствию одной пурин-акцепторной связи, однако, если отсутствие двойное он становится неактивным по отношению к такому субстрату.

Важность 3-N атома среднего аденина в участке узнаваемом рестриктазой Bgl II (5'AGATCT) была установлена с помощью декануклеотида, в котором обсуждаемое основание заменено на 3-деазааденин (отсутствует 3-N атом) [285]. Рестриктаза Bgl II была неспособной расщепить такой субстрат, хотя связывание с исследуемым декамером не было нарушено [285].

Проведение эксперимента с этим же субстратом и рестриктазами Mbo I (5'GATC) и Sau3A I (5'GATC) показало, что

6-5933

81

обе они слабо гидролизировали модифицированные субстраты [285]. Авторы обсуждаемой публикации делают вывод, что эти ферменты взаимодействуют с малым желобом ДНК, а замедление расщепления объясняется изменением способа их связывания с модифицированным субстратом.

7.1.2. Тимин

Наиболее хорошо исследовано образование гидрофобного контакта рестриктаз с 5-метильной (5-СНз) группой тимина (Т), расположенной в большом желобе [12, 90, 127, 215, 377, 410]. Рестриктазы по разному реагируют на присутствие этой группы в своем сайте, например, для активности EcoR II [12, 19, 410], Нра I [127] эта группа является необходимой, а для Mva I она не имеет значения [215].

Роль 5-СН3 группы во взаимодействии эндонуклеаз рестрикции с ДНК исследуется при помощи олигонуклеотидов, содержащих участки узнавания соответствующих рестриктаз, в которых тимин заменен на урацил (U) [90, 215, 377], 5-бромура-цил (5BrU) [90, 127, 377, 410] или 5-фторурацил (5flU) [12, 215]. Замена тимина на урацил устраняет 5-СН3 группу из большого желоба и замещает ее на атом водорода (5-Н). В случае исследования взаимодействия с субстратом рестриктазы EcoRI (5'GAATTC), внутренний Т в сайте узнавания был заменен на U. Расщепление такого субстрата происходило наравне с каноническим, однако при замене внешнего Т, расщепления не наблюдалось [90]. Соответствующая замена Т на 5BrU приводило к ускорению гидролиза в первом случае и к незначительному расщеплению во втором случае [90]. Исходя из этих данных, делается вывод о том, что 5-СН3 группа внутреннего Т не является важным контактом (хотя Km этого субстрата указывает на ее участие в связывании с ферментом). Напротив эта же группа внешнего Т существенно влияет на взаимодействие с рестриктазои EcoR I.

Для объяснения отсутствия расщепления олигонуклеотида рестриктазои EcoR I, в котором вместо внешнего Т находится 5'G+AATU С привлекаются данные о возможном изменении З'С UTAA^G

конформацни модифицированного субстрата. Результаты ЯМР анализа [123] самокомплементарного олигонуклеотида 5'CTACGUAG, содержащего А—U пары оснований свидетель-3'GAUGCATC

ствуют, что N-гликозидные связи этих пар и А—Т пар прилегающих с З'-конца, являются искаженными [123]. Возможно, что такие искажения и влияют на взаимодействие рестриктазы EcoR I с вышеуказанным модифицированным субстратом. Обращает на себя внимание тот факт, что замена Т на U про-

82

ведена в таком положении сайта, где находится расщепляемая фосфодиэфирная связь.

В случае изучения рестриктазы Нра I (5'GTT*AAC) заменам на U или на 5BrU подвергался Т, находящийся около-расщепляемой фосфодиэфирной связи, [127]. Первая замена блокировала гидролиз олигонуклеотида, а вторая — приводила к появлению незначительного количества продуктов рестрикции. Из этого был сделан вывод, что 5-СН3 группа тимина участвует в образовании гидрофобного контакта с ферментом-Способность рестриктаз Нра I и EcoR I расщеплять Хромированный субстрат указывает, что атом брома может компенсировать потерю 5-СНз группы путем вступления в прямой контакт с ферментом, так как Ван-дер-вальсовый радиус атома брома близок радиусу метильной группы, только он является более электроотрицательным. Наличие атома Вг в пиримиди-новом кольце меняет распределение электронов и таким образом может влиять на взаимодействие пиримидина с соседними основаниями или белком [265].

Имеется публикация [377], авторы которой показали, что замещение обоих Т на U в сайте REcoR I (5'GAATTC) не влияет на скорость его расщепления. Строго говоря нельзя утверждать, что полученные результаты противоречат рассмотренным выше, т. к. в этом случае Т на U в сайте REcoR I замещались по одиночке [90]. Таким образом сравниваемые данные получены с разными субстратами. Однако, отсутствие эффекта замещения обоих Т на U на расщепление субстрата ферментом как бы указывает, что 5-СНз группы Т являются несущественными для контакта с REcoR I. Авторы все-таки на основе данных о том, что замещение наружного Т на 5BrU дает ускорение реакции расщепления, делают вывод о том, что метальные группы контактируют с REcoR I [377].

Для рестриктазы EcoR II (5'CC(T/A)GG) тоже подтверждено наличие контакта с метильной группой центрального Т (замена его на U [410] и 5flU [12] замедляет, а наличие 5BrU [19]—ускоряет гидролиз (по сравнению с каноническим оли-гонуклеотидом). Следует отметить, что модификация одной цепи влияет на расщепление обеих цепей.

По-видимому, в случае EcoR II, фермент вступает в контакт с атомом фтора, но этот контакт существенно отличается от контакта с метильной группой [308]. С другой стороны субстрат, содержащий 5flU [215], нарушает конформацию олигонуклеотида и оказывает дестабилизирующее влияние на 5flU — А пару оснований [116].

Рестриктаза Mval (5'CC+(A/T)GG)