Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

27, 233].

Введение или удаление каких-либо функциональных групп позволяет изучить определенные элементы и стадии взаимодействия, однако, выбирая тип модификации, желательно стремиться к максимальной изостеричности модифицированных дуплексов с канонической ДНК, так как, в зависимости от природы конкретной модификации, возможно локальное искажение структуры всего участка узнавания или затруднение конформационных переходов ДНК и фермента, необходимых для узнавания и взаимодействия. Упомянутое обстоятельство является самым слабым местом настоящего метода, значительно затрудняющее интерпретацию результатов, однако, считается, что создавая большое число разнообразных модификаций субстратов, можно, компенсируя недостатки каждого, получать достоверную картину взаимодействия в целом.

Возможны два способа получения модифицированных ДНК-субстратов— химическая модификация канонического субстрата и введение модифицированного основания в ходе его синтеза. Субстраты синтезированые химическим методом имеют некоторые преимущества перед макромолекулярными ДНК. В первую очередь в олигонуклеотиды легче ввести задуманную модификацию при его конструировании, чем модифицировать природную ДНК, а затем убеждаться в полноте ее модификации. Применяя синтетические олигонуклеотиды, можно оценить расщепление сайта с различным нуклеотидным окружением в отсутствии других эффектов, например, сверхскрученности ДНК, неканонических вторичных структур (например, Z-ДНК или крестообразные структуры остова), а также неспецифического взаимодействия ферментов с другими сайтами. Для выяснения картины взаимодействия рестриктаз с ДНК, создаются синтетические ДНК-фрагменты имеющие

78

модификации как в участке узнавания, так и в прилегающих, областях.

В рамках настоящего обзора сделана попытка обобщить имеющиеся в литературе данные о взаимодействии рестриктаз с синтетическими ДНК-фрагментами, содержащими как канонические, так и модифицированные участки узнавания. Существующие физико-химические и энзимологические методы позволяют охарактеризовать разные аспекты этого взаимодействия: (а) локализовать важные точки контакта или сближения с ДНК; (б) выяснить общие закономерности и индивидуальные особенности механизма действия этих сайт-специфических ферментов.

Следует еще раз подчеркнуть, что интерпретация результатов взаимодействия модифицированных субстратов с рестриктазами весьма непростая задача. В случае отсутствия надежной физико-химической и структурной характеристики модифицированного субстрата, вопрос о значимости изучаемой модификации всегда остается открытым, так как изменение поведения фермента всегда можно отнести к изменению конформации самого субстрата вследствии модификации. С другой стороны, отсутствие расщепления модифицированного сайта может быть обусловлено как нарушением стадии узнавания, так и стадии расщепления. И в этом случае возможна неоднозначная интерпретация важности исследуемой точки контакта. Из этого следует, что для надежной интерпретации результатов взаимодействия рестриктаз с модифицированными субстратами требуются дополнительные исследования, которые, порой, являются более сложными, чем само исследование взаимодействия. В большинстве работ по этой теме такие данные отсутствуют, поэтому обобщения следует делать очень осторожно.

7.1. Роль отдельных групп атомов гетероциклических оснований участка узнавания

Как известно, эидоиуклеазы рестрикции, при осуществлении процесса узнавания и расщепления, в большинстве случаев взаимодействуют с большим желобом двойной спирали ДНК [282, 338, 410]. Самым наглядным подтверждением этого является рентгеноструктурное изучение кокристалла рестриктазы EcoR 1 и сайт-содержащего олигонуклеотида [45, 137]. Однако, в литературе также обсуждается и не менее важная роль малого желоба ДНК во взаимодействии с некоторыми рестриктазами [90, 127, 233, 265, 285].

Обобщение результатов работ ряда авторов позволяет выявить значение отдельных химических групп и атомов оснований, расположенных в большом и малом желобах, при взаимодействии ферментов рестрикции с узнаваемой последовательностью. Так как во всех участках узнавания находятся одни

79

и те же основания (A, G, Т, С), только в различных комбинациях целесообразным является рассмотрение роли каждого гетероциклического остатка в отдельности.

7.1.1. Аденин

Наиболее исследованы положения аденина (А)—экзоци-клическая аминогруппа (6-NH2) и атомы азота в положении 7 (7-N) (расположенный в большом желобе) и 3 (3-N) (малый желоб).

Для выяснения роли 6-NH2 группы, аденин заменяют на М6-метиладенин (ю6А), т. е. один водород в NH2 группе заменяют на метильную группу, [29, 90, 284], или на 2-аминопурин (2АР), который лишен этой группы [90].

Большинство рестриктаз проявляют чувствительность к метилированию аденина в своих участках узнавания. Рестриктазы EcoR I (5'GAATTC) [90], Mbo I (5'GATC) [284] не расщепляют субстратов, содержащих метилированные основания аденина. Также ведет себя и рестриктаза Mva I (5'СС(T/A)GG) по отношению к метилированной цепи ДНК-дуплекса, а рестриктаза EcoR II (5'СС (Т/А) GG) значительно труднее гидро-лизует обе цепи [29]. Такое поведение можно объяснить стери-ческими эффектами СН3-группы, которые препятствуют образованию необходимых контактов фермента с большим желобом ДНК. С другой стороны, метилирование аминогруппы может препятствовать образованию водородных связей между свободным водородом группы 6-NH2 и аминокислотным остатком белка. Хотя обсуждаемое метилирование не препятствует спариванию оснований [133], оно устраняет водород, который мог бы участвовать в формировании связи с ферментом, Структура кокристалла EcoRI — олигонуклеотид указывает на участие свободного водорода 6-NH2 группы аденина в образовании связи с остатком глутаминовои кислоты белка [137].

Таким образом, можно сделать предварительный вывод, что 6-NH2 группа важна для проявления активности рестриктаз EcoRI [90], EcoR II [29], Mbo I [284] и Mva I [29], но совсем не обязательна для рестриктазы Sau3A I (5'GATC) (введение М6-метиладенина не препятствует гидролизу) [284]. Упомянутые рестриктазы Sau3A I и Mbo I узнают одинаковую последовательность нуклеотидов, одинаково расщепляют тот же сайт, поэтому можно сделать вывод о разных механизмах их действия.

Нужно отметить, что для рестриктаз не безразлично, в каком положении узнаваемого участка находится Ы6-метилиро-ванное основание аденина. Рестриктаза Bgl II (5'АЮАТСТ) расщепляет олигонуклеотид, несмотря на введение СН3-группы в среднее звено участка узнавания, но не расщепляет (хотя и хорошо связывается), если СН3-группа находится в левом

80

крайнем аденине [284]. Рестриктаза МП I (5'РиЮАТСРу) ведет себя противоположным образом.

Для более глубокого исследования значимости №-метили-рования центрального аденина в участке узнавания рестриктазы EcoR I, исследовалась его замена на 2-аминопурин (2-АР) [90]. Эта замена устраняет №-аминогруппу из большого желоба, но вводит NH2-rpynny во второе положение, экспонированное в малом желобе, которая образует

страница 26
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.09.2019)