6]. В области температур 25—37° С накопление кольцевой формы ДНК в растворе не наблюдается, так как расщепление обеих цепей ДНК происходит, по-видимому, в составе одного из того же фермент-субстратного комплекса, с образованием линейной формы ДНК. Однако, в области температур 40—55° С, наряду с образованием линейной формы ДНК, наблюдается накопление кольцевой формы ДНК-

Можно предположить что изменение механизма реакции в зависимости от температуры, связано с различным ее влиянием на отдельные кинетические константы элементарных стадий реакции гидролиза и смене лимитирующей стадии реакции гидро-

72

лиза при изменении температуры. Так, если предположить, что при низких температурах (0—10° С) k5>k3, то промежуточная форма ДНК, содержащая однонитевый разрыв (форма II), будет накапливаться в растворе. При повышении температуры (в области температур 25—37° С) из-за предполагаемой разницы в энергиях активации процессов может реализоваться обратное соотношение констант скоростей элементарных стадий, а именно, кз>К5. Это должно привести к тому, что не будет наблюдаться накопления формы ДНК, содержащей однонитевый разрыв в растворе.

Следуя логике вышеизложенных рассуждений аналогично можно объяснить и влияние фланкирующих участков узнавания последовательностей, что имеет место в случае ДНК SV 40, ColE I и G4. Это влияние может проявиться именно на «кинетических» стадиях реакции, приводя к изменению ее энергии активации, в результате дополнительных взаимодействий определенных нуклеотидных последовательностей с ферментом в переходном состоянии реакции и, тем самым, оказывать влияние на лимитирующую стадию процесса.

Дальнейшее развитие исследования по изучению механизма гидролиза плазмидной ДНК эндонуклеазами рестрикции получили в работах Халфорда с сотр. [159—162, 164, 245, 246]. В результате кинетических исследований процесса гидролиза плазмиды рМВ9, содержащей один участок узнавания рестриктазы EcoR I, было установлено, что происходит накопление в растворе формы ДНК, содержащей однонитевый разрыв. Таким образом механизм реакции является аналогичным таковому, предложенному для гидролиза ДНК вируса SV 40 рестриктазой EcoR I [328].

Изучение этой реакции, в условиях избытка фермента относительно субстрата, при использовании непрерывного метода регистрации активности эидоиуклеазы EcorR I методом флуоресценции [159] позволило выявить дополнительные детали в механизме гидролиза ДНК-

Было показано, что вариант гидролиза плазмидной ДНК рМВ9 эндонуклеазой рестрикции EcoR I зависит от начального состояния реакции: в том случае, когда реакция начиналась смешиванием раствора фермента с раствором ДНК, содержащим ионы Mg2+, реакция шла по пути образования свободной формы ДНК II (содержащей однонитевый разрыв). Однако, в том случае, когда на первой стадии реакции происходило смешивание раствора фермента с ДНК с последующим добавлением ионов Mg2+, реализовался механизм гидролиза ДНК, приводящий к одновременному расщеплению обеих цепей ДНК в составе одного и того же фермент-субстратного комплекса.

Для объяснения этих фактов было выдвинуто предположение, что лимитирующей стадией гидролиза являются конформа-

73

ционные превращения рестриктазы, протекающие при связывании с ДНК. В первом случае, при образовании комплекса ДНК с рестриктазои EcoR I, происходят конформационные из. менения в одной субъединице фермента, в результате которых эта субъединица фермента активируется и осуществляется расщепление фосфодиэфирной связи в одной цепи ДНК. Однако, так как конформационные изменения протекают медленнее всех других стадий, фермент успевает диссоциировать с ДНК до активации следующей субъединицы. Во втором случае, когда на первой стадии реакции образуется комплекс фермента с ДНК и реакция начинается добавлением ионов Mg2+, проходит время, достаточное для активации в результате конформационных изменений обеих субъединиц, что и приводит к реализации согласованного механизма расщепления субстрата при добавлении ионов Mg2+. На первый взгляд эта гипотеза опровергала предположение, что различия в механизме гидролиза ряда ДНК зависит от нуклеотидных последовательностей, окружающих участок узнавания. Это противоречие могло бы быть исключено в том случае, если фланкирующие нуклеотидные последовательности оказывают влияние, именно, на скорость конформационного перехода, приводящего к активации фермента в комплексе с ДНК, что позволило бы согласовать обе гипотезы. Гипотеза о конформационных изменениях в рестриктазе EcoR I, протекающих в комплексе с ДНК, еще ждет экспериментальной проверки.

Несмотря на то, что кинетика гидролиза кольцевых молекул ДНК другими эндонуклеазами рестрикции П-го типа, исследована в настоящее время для узкого круга рестриктаз, имеющиеся данные подтверждают общность механизма, предложенного для рестриктазы EcoR I и детально обсужденного выше. Так было показано [159], что при гидролизе плазмидных ДНК рестриктазами Sal I и BamH I, не наблюдается накопления промежуточного продукта в виде кольцевой ДНК, содержащей однонитевый разрыв и расщепление обеих цепей ДНК происходит, по-видимому, в составе одного и того же промежуточного фермент-субстратного комплекса. Однако, в случае гидролиза плазмиды рМВ9 рестриктазои BamH I, при температуре 1°С, показано [355] накопление промежуточной формы ДНК, содержащей однонитевый разрыв. Механизм гидролиза плазмидных ДНК, приводящий к накоплению промежуточного продукта в виде кольцевой ДНК был также установлен для Нра II [327] и Hha II [197].

6.1.3. Исследование процесса гидролиза линейных форм ДНК эндонуклеазами рестрикции

В предыдущем разделе, посвященном обсуждению механизмов гидролиза двухспиральной ДНК, речь в основном шла о

74

взаимодействии с кольцевыми формами ДНК. Использование этих субстратов имеет некоторые преимущества перед линейными. Во-первых исследование кинетики гидролиза таких ДНК молекул затруднено, так как в случае применения метода электрофореза необходимо использовать специальные приемы для идентификации однонитевого разрыва. Во-вторых, длинные линейные двухспиральные молекулы, например, ДНК фага X, содержат обычно несколько участков узнавания, которые как было показано в классической работе [371], расщепляются рестриктазой EcoR I с различной скоростью. Это затрудняет кинетический анализ. Более подробно этот вопрос был изучен [162] на делеционных вариантах ДНК фага %, содержащих уникальные участки узнавания рестриктазы EcoR I в различном окружении. Было установлено, что при низких ионных силах (порядка 50 мМ NaCl) не наблюдается различий в реакционной способности разных участков узнаваемых рестриктазой EcoR I, что определенным образом противоречило данным другой публикации [371]. Однако неодинаковая скорость расщепления различных участков узнавания в последнем случае была обнаружена при более высокой (порядка 150 мМ NaCl) ионной силе. Было выдвинуто предположение [162], что разница в скорости гидролиза различных участков узнавания имеет кинетическую природу, т. е. обусловлена неодинаковым взаимодействием нукл