Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

9—Ю-10 М). Несмотря на то, что константа Михаэлиса в большинстве случаев является эффективной величиной и не является истинной мерой связывания субстрата с ферментом, низкие значения этой константы отражают высокое сродство рестрикционных эндонуклеаз с ДНК;

2) максимальная скорость реакции гидролиза ДНК эндо-нуклеазами рестрикции является сравнительно низкой. Так значения каталитической константы Ккат, являющейся мерой числа оборотов или каталитических актов в определенный интервал времени, находятся в интервале 0,12—8 мин-1. Таким образом

Таблица 20

Кинетические параметры некоторых рестрикционных эндонуклеаз

Фермент KM, MxlO— Ккат мин- Субстратная ДНК Литература EcoR I 8 3,8 8 ColE I [266

EcoR I 3 ColE I 398

EcoR I 3 — OolE I 399

EcoR I 0,4 1 ColE I '398

EcoR I 5 13 pBR322 225

EcoR I 10 1,3 1 [751

EcoR I 30 1,5 SV 40 [149] BamH I 0,3 2,2 pJC80 176] BamH I 0,36 —. pJC8Q> 176] BamH I 0,9 — pJC80 175] Нра II — 0,18 SV 40 ГВЦ

Bgl H — 1,75 p2Hl [185] SalQ I 0,5 0,12 pMB9 [245] видно, что рестрикционные эндонуклеазы являются «медленными» ферментами.

Причины этого явления можно раскрыть, анализируя отношение Ккат/Км, представляющие собой кажущуюся константу скорости второго порядка для реакции между свободным ферментом и свободным субстратом. Как можно легко подсчитать из данных, приведенных в табл. 20, для ферментов EcoR I и BamH I величина значения параметра Ккат/Км лежит в области значений 107—108 М/с-1 и приближаются к лимитируемой диффузией частоте столкновения между субстратом и ферментом [327]. Таким образом, низкие значения каталитической константы скорости реакции при гидролизе ДНК, являются следствием высокоспецифичного связывания ДНК с эндонуклеазой рестрикции. С другой стороны, значения параметра Ккат/Км, приближающегося к диффузионно-лимитируемому значению указывают на то, что рестрикционные эндонуклеазы являются эволюционно совершенными ферментами, т. е. биокатализаторами, приблизившимся к пределу ускорения данной химической реакции. Следует еще раз подчеркнуть, что низкая скорость каталитического превращения ДНК эндонуклеазой рестрикции является своего рода платой за очень высокое сродство фермента к специфическим последовательностям ДНК-

6.1.2. Механизм реакции гидролиза кольцевых форм ДНК эндонуклеазами рестрикции

Изучение механизма реакции гидролиза субстрата эндонуклеазами рестрикции является одним из основных этапов исследования природы взаимодействия ДНК с этими ферментами.

70

Механизм реакции гидролиза ДНК эндонуклеазами рестрикции П-типа наиболее подробно изучен для рестриктазы EcoR I. Так уже в первой работе [266], посвященной изучению физико-химических и каталитических свойств эидоиуклеазы рестрикции EcoR 1, было показано, что при гидролизе кольцевой суперспиральной формы ДНК ColE I, содержащей уникальный участок узнавания рестриктазы EcoR I, в определенных условиях наблюдается накопление промежуточного соединения реакции гидролиза плазмидной ДНК, а именно, кольцевой формы ДНК, содержащей однонитевый разрыв. Это позволило авторам [266] предположить, что расщепление отдельных цепей двух-спиральной ДНК ColE I рестриктазой EcoR I происходит не одновременно, а последовательно, и при определенных условиях возможна диссоциация фермент-субстратного комплекса — промежуточного продукта гидролиза ДНК. Количество кольцевой формы ДНК, содержащей однонитевый разрыв, зависело от температуры: при температуре 0° С кольцевая форма ДНК, содержащая однонитевый разрыв составляла >90%, а при температуре 30° С, накопления в растворе такой ДНК не наблюдалось. Однако, проведение реакции гидролиза ДНК ColE I при температуре 30° С при более низкой концентрации субстрата, позволило выявить образование кольцевой формы ДНК и в этих условиях [327]. Таким образом было показано [266, 327], что расщепление ДНК ColE I рестриктазой EcoR I осуществляется при определенных условиях по несогласованному механизму, т. е. сначала происходит гидролиз одной цепи ДНК с образованием промежуточной формы, содержащей однонитевый разрыв, а затем расщепляется вторая цепь. Однако в зависимости от температуры, расщепление второй цепи может происходить и в составе одного и того же фермент-субстратного комплекса.

Дальнейшее детальное изучение [328] кинетики реакции гидролиза ряда кольцевых форм ДНК, таких как ДНК вируса SV 40, ДНК репликативной формы бактериофага G4 и ДНК ColE I, эндонуклеазой рестрикции EcoR I в условиях избытка субстрата при температуре 37° С, показало, что в случае ДНК фага G4 и ДНК ColE I не наблюдается накопления промежуточной формы ДНК, содержащей однонитевый разрыв. При гидролизе ДНК вируса SV 40 в этих же условиях в растворе накапливается около 25% ДНК в такой форме. В результате этих исследований [328] была предложена следующая общая кинетическая схема гидролиза двухцепочечной плазмидной ДНК эндонуклеазой рестрикции EcoR I:

1*1

71

где I — суперспирализованная кольцевая форма ДНК;

II — кольцевая форма ДНК, содержащая однонитевый разрыв;

III — линейная форма ДНК-Согласно предложенной схеме на первой стадии процесса происходит образование фермент-субстратного комплекса E-I эндонуклеазы рестрикции EcoR I и двухцепочечной плазмидной ДНК. Ключевым моментом схемы является образование комплекса Е-II эндонуклеазы рестрикции EcoR I с кольцевой формой ДНК, содержащей однонитевый разрыв, полученной в результате гидролиза фосфодиэфирной связи в одной из цепей ДНК- В дальнейшем в зависимости от условий (природы субстрата, температуры и т. д.) может происходить или расщепление второй цепи ДНК в составе того же комплекса Е-II с образованием комплекса Е-III-фермента с линейной формой ДНК или диссоциация комплекса Е-II с образованием свободного фермента и кольцевой ДНК, содержащей однонитевый разрыв, что и приводит к накоплению формы II в растворе. Эта схема позволила объяснить различия в механизмах гидролиза ДНК вируса SV 40 с одной стороны и ДНК ColE I и бактериофага G4 с другой. В случае ДНК вируса SV 40 происходит диссоциация фермент-субстратного комплекса Е-II, приводящая к накоплению кольцевой формы ДНК в растворе. Было высказано предположение, что различия в механизме гидролиза этих ДНК молекул (вируса SV 40; ДНК ColE I и бактериофага G4) являются результатом взаимодействия рестриктазы EcoR I с различными нуклеотидными последовательностями, фланкирующими участок узнавания рестриктазы EcoR I. Однако, такое предположение не позволяет объяснить различия в механизме гидролиза кольцевой ДНК ColE I в зависимости от температуры (см. выше).

Детальное изучение [34] влияния температуры на гидролиз ДНК ColE I рестрикционной эндонуклеазой EcoR I выявило довольно сложную зависимость механизма реакции от температуры. Так, в области температур 0—10° С, наблюдается накопление в растворе формы ДНК, содержащей однонитевый разрыв, что подтверждает данные работы [26

страница 23
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(12.11.2019)