Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

Как видно из данных, представленных в табл. 19, некоторые рестриктазы, такие как Bgl I, Bsp I, Ben I, EcoR V и др., существуют в растворе в форме мономера, а для некоторых рестриктаз, таких как BamH I, EcoR I, EcoR II и ряда других, установлена субъеди-ничая организация фермента. Так для рестриктазы EcoR I было показано [266], что обычно в растворе активной формой являет -

66

Таблица 19

Некоторые физико-химические свойства гомогенных препаратов эндонуклеаз рестрикции

Рестриктаза Узнаваемая последовательность Мол. масса*, Дальтоны Активная форма фермента р! Литература BamH I GGATCC 22 000±500 димер 5.3 [3551

TGATCA (тетрамер)

Bel I 25 000 димер [83]

Bgl I GCCNNNN- 31 ООО мономер [80]

NGGC

61 ООО димер [196] Bgl II AGATCT 127 ООО димер [81, 185,

35 ООО мономер 294] Bsp I GGCC 35 000 мономер [207, 210] Ben I CCGG 28 000±1500 мономер 6,2 [290] Bsu I GGCC 68 000 мономер [93, 95] Bst I GGATCC 26 000 мономер [П2]

димер

Dpn I GATC 20 000** [220] Dpn II GATC 70 ООО** димер [219] EcoR I GAATTC 28 5О0±50О тетрамер димер 6,3 [266]

тетрамер

EcoR II CC(A/T)GG 40 ООО димер [821

44 000±1000 димер [23]

EcoR V GATATC 25 000 мономер! [ЗП

Hind II GTPyPuAC 70 000 [354] Hha II GANTC 24 000 димер [239] Нра I GTTAAC' 29 000 мономер [173]

34 000

Нра II CCGG 40 000 мономео [174]

(димер)

Mva I CC(A/T)GG 31 300 ±400 мономер 4,6 [381

Hgo II GGCC 11 ООО гексамер [ПО]

65 000*

Pal I GGCC 31 0О0±1000 димер 5,3 [71]

SalG I GTCGAC 29 000 димер [244]

Taq I TCGA 22 5О0 мономер '335]

Xho I CTCGAG 21 000 димер 145]

* — по данным SDS электрофореза в полиакриламидном геле ** — по данным гель фильтрации

ся димерная форма фермента, однако, при более высоких концентрациях белка, возможно образование тетрамеров. Субъединичное строение комплекса рестриктазы EcoR I с ДНК было подтверждено методом рентгено-структурного анализа [250].

Следует отметить относительно высокую склонность к агрегации в растворе некоторых эндонуклеаз рестрикции. Так, эн-донуклеаза рестрикции BamH I в растворе обычно существует в форме димера или тетрамера [355], однако, при низких ион-

67

ных силах, отмечено существование ряда мультимерных форм, вплоть до гексадодекамера [172]. Таким образом, по-видимому, ряд рестриктаз в растворе, в зависимости от условий (концентрации белка, ионная сила, рН и др.) могут существовать в различной структурной форме, не исключая и мономерную форму фермента. Следует подчеркнуть, что в случае RMva I, для которой не удалось показать существования четвертичной структуры при разных условиях, была обнаружена [38] димеризация фермента при образовании комплекса с ДНК, что может быть справедливо и для других рестриктаз, для которых было определено наличие только мономерной формы.

Как можно судить по немногочисленным данным относительно изоэлектрической точки эндонуклеаз рестрикции (см. табл. 19), рестриктазы являются слабокислыми белками (значения pi находятся в области 4,6—6,3). Этот факт, на первый взгляд, вызывает некоторое изумление, так как наличие отрицательного заряда на белковой глобуле должно препятствовать образованию комплекса с отрицательно заряженной молекулой ДНК, однако, не следует забывать, что изоэлектрическая точка отражает электростатическое состояние всей белковой глобулы и поэтому не исключает существования положительно заряженных участков.

6. ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ СВОЙСТВА РЕСТРИКТАЗ

Рестрикционные эндонуклеазы П-го типа являются гидролазами, специфически взаимодействующими с определенными короткими нуклеотидными последовательностями двухцепочечной ДНК и расщепляющими фосфодиэфирную связь в определенном месте относительно участка узнавания. Несмотря на то, что в настоящее время известно более 1000 рестриктаз, и более ста среди них широко используются в качестве аналитических реагентов, кинетика и механизм реакций катализируемых этими ферментами изучены недостаточно. С чем это связано? Во-первых, в большинстве экспериментов обычно используется избыток эндонуклеазы рестрикции, чтобы обеспечить полное расщепление ДНК, поэтому не требуется знания определенных кинетических параметров фермента. Во-вторых, для изучения кинетики реакций ДНК с эндонуклеазами рестрикции, используются довольно сложные и относительно длительные количественные методы регистрации каталитической активности рестриктаз, например, разделение рестрикционных фрагментов ДНК электрофорезом в агарозном или полиакриламидном геле с последующим определением относительного количества продуктов УФ-сканированием геля, «окрашенного» бромистым этидием (или фотонегатива этого геля) или подсчетом радиоактивности фрагментов при использовании меченной ДНК (разд. 1, часть II).

68

Следует отметить, что методы, предложенные для количественной регистрации активности рестриктаз являются методами с отбором проб в течение реакции и только в одной работе [159] был предложен непрерывный количественный метод регистрации скорости гидролиза ДНК, основанный на измерении флуоресценции при гидролизе кольцевой ДНК с интеркалированным бромистым этидием. В-третьих, для структурно-кинетических исследований рестриктаз требуются довольно большие количества, желательно, гомогенного белкового препарата фермента, что стало реальным лишь в последние годы в результате работ по клонированию генов целого ряда рестриктаз и созданию супер-продуцентных штаммов (см. разд. 5, часть II). В последние годы интерес к структурно-кинетическому изучению рестриктаз стал возрастать в связи с развитием исследований, направленных на установление механизма специфического узнавания ДНК белками, так как в этом ключе эидоиуклеазы рестрикции являются исключительно интересными объектами.

6.1. Каталитические свойства рестрикционных эндонуклеаз

6.1.1. Эффективные кинетические параметры

В большинстве работ по изучению кинетических свойств эндонуклеаз рестрикции, обычно, ограничиваются лишь определением кажущихся значений кинетических параметров: константы Михаэлиса Км и каталитической константы Ккат и максимальной скорости Vm. В таблице 20 приведены кинетические параметры реакции гидролиза ДНК для ряда рестрикционных эндонуклеаз.

Несмотря на то, что кажущиеся значения Км являются мало информативными в кинетическом смысле (так как не позволяют прогнозировать механизм каталитического превращения субстрата), анализ данных, приведенных в табл. 20 позволяет сделать несколько заключений общего характера:

1) взаимодействие эндонуклеаз рестрикции с ДНК характеризуется очень низкими значениями константы Михаэлиса (в большинстве случаев порядка 10~

страница 22
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(12.11.2019)