Биологический каталог




Ферменты рестрикции и их применение

Автор А.А.Янулайтис

на разработку методов мегабазового картирования ДНК, так как ассортимент прототипов с более чем семичленными узнаваемыми участками пока ограничен несколькими наименованиями. Для увеличения специфичности предлагается комбинация мети-лазы, образующей т6А в участках, перекрывающихся с последовательностью узнаваемой RDpn I — Gm6ATC. Так, совместное применение этого фермента с MTaq I, узнающей тетрануклео-тид 5'TCGm6A и метилирующей в нем аденин дает расщепление 8-ми звенных участков 5'TCGmATCGA а комбинация

3'AGC TmAGCT

с MMbo II (GAAGm6A) к декануклеотидному сайту 5'GAAGmA ТСТТС З'СТТС TmAGAAG [256].

Недавно предложен подход получения 10—14-тинуклеотидного «узнавания» при помощи двух метилаз и рестриктазы [257]. Он основан на чувствительности метилаз к определенным вариантам неканонического метилирования. Например, в случае наличия последовательности 5'CCGGATCCGG, представляющей собой участок узнаваемый RMBamH I (5'GGATCC), перекрытый с обеих сторон сайтами МНра II (5'CCGG), метилирование ДНК метилазой Нра II приводит к модификации крайних ци-тозинов сайта BamH I:

5'CmC GGATCC GG 3'G GmCCTAG GmCC

Такая модификация защищает узнаваемый участок от действия MBamH I, в то время как все другие участки ДНК 5'GGATCC метилируются этой метилазой по внутреннему цитозину и защищаются от действия RBamH I. Последующая обработка ДНК препаратом RBamH I приводит к расщеплению по указанным 10-ти звенным сайтам, так как рестриктаза нечувствительна к модификации внешних цитозиновых остатков [257].

Место расщепления субстрата не играет роли при физическом картировании ДНК. Но существует ряд задач, для которых структура концов имеет вполне определенное значение. Фрагменты с выступающим З'-концом могут быть удлинены с помощью терминальной трансферазы [326]. Это находит применение в опытах по клонированию ДНК [187]. Наличе липких концов облегчает получение рекомбинантных ДНК in vitro. Однако рекомбинанты можно получать только с фрагментами, образованными действием на субстрат одной и той же рестриктазы или рестриктаз, узнающих различающиеся последовательности, но образующих идентичные липкие концы. Примерам может быть пара рестриктаз BamH I и Sau3A I, узнающих соот-

64

ветственно 5'G*GATCC [374] и 5'*GATC [362] и расщепляющих их в местах указанных стрелками.

С практической точки зрения представляют интерес альтернативные прототипы, различающиеся по месту расщепления субстрата, расширяющие потенциальные возможности проведения экспериментов. Например, при получении рекомбинантных молекул ДНК использование рестриктазы, дающей тупые концы вместо липких, позволяет клонировать по этому сайту вектора любые тупоконечные фрагменты.

Интересные возможности представляют рестриктазы, узнающие определенную последовательность нуклеотидов, но дающие разрыв в стороне с образованием выступающих концов. Эти ферменты были отнесены к I IS типу [364]. Если таким ферментом разрезать ДНК, то при действии лигазы in vitro она соберется в первоначальную структуру. Таким образом, можно ре-синтезировать в пробирке небольшой геном или его отдельные части [49].

Благодаря работам Подхайской и Шибальского [296, 364], способность рестриктаз I IS типа расщеплять в стороне от узнаваемого участка нашла оригинальное применение для расщепления однонитевой ДНК в любом предетерминированном сайте. Впервые это было продемонстрировано на примере RFok I [296]. Это подход реализуется таким образом, что синтезируется олигонуклеотид, содержащий в одном конце самокомплементарные последовательности, которые после спаривания образуют участок узнаваемый RFok I. Структура другого конца подбирается таким образом, чтобы она была комплементарной к участку исследуемой однонитевой ДНК в том месте, где планируется провести ее расщепление. После гибридизации синтетического олигонуклеотида с ДНК образуется двухнитевая структура, содержащая сайт узнаваемый RFok I и следующий за ним участок исследуемой ДНК. Обработка такого комплекса ферментом дает расщепление субстрата в выбранном месте.

В настоящее время, как уже отмечалось, известны 143 прототипа рестриктаз. Таким образом, имеется возможность расщеплять ДНК по 143 различающимся по структуре участкам. В конкретных экспериментах весь этот набор конечно не используется. Вместе с тем успешное решение таких задач, как физическое картирование различных ДНК, выделение их фрагментов, определение нуклеотидной последовательности, разрыв ДНК в желаемом месте (например, сразу за структурной частью гена) во многом зависит от возможностей, представленных существующими вариантами субстратной специфичности рестриктаз. Учитывая большое структурное разнообразие ДНК очевидно, что имеющийся набор этих ферментов еще далек от удовлетворения всех нужд научных исследований. Поэтому поиск рестриктаз, обладающих способностью специфически расщеплять ДНК в ранее недоступных для этого местах, не теряет

5-5ЭЗЗ

65

актуальности. Актуальным является и выявление альтернативных прототипов — ферментов, узнающих одинаковые последовательности нуклеотидов, но расщепляющих их в разных местах или рестриктаз по разному чувствительных к характеру метилирования субстрат. За их счет число «прототипностей», характерных для известных рестриктаз, достигает 166. В это число входит 143 прототипов по узнаваемой последовательности нуклеотидов, 10 альтернативных по месту расщепления и 13 — по чувствительности к метилированию. С практической точки зрения это означает, что имеется 166 возможностей различного исхода воздействия рестриктаз на субстрат.

5. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РЕСТРИКЦИОННЫХ ЭНДОНУКЛЕАЗ

Основным требованием при использовании рестриктаз в генно-инженерных и других молекулярно-генетических экспериментах является функциональная чистота, а именно, отсутствие примесей неспецифических нуклеаз и фосфатаз. Поэтому, основные усилия при выделении и очистке рестрикционных эндонуклеаз направлены на получение функционально чистых их препаратов. Однако, для структурно-кинетических исследований эндонуклеаз рестрикции требуются относительно большие количества гомогенных препаратов ферментов. Несмотря на то, что как уже отмечалось, в настоящее время охарактеризовано (и в большинстве случаев выделено) более 1000 рестриктаз, лишь небольшая их часть получена в гомогенном состоянии.

Физико-химические свойства гомогенных препаратов рестриктаз в настоящее время изучены недостаточно (исключение составляет только рестриктаза EcoR I) и в большинстве случаев ограничены определением молекулярной массы методами гель-фильтрации и электрофореза. В таблице 19 приведены некоторые физико-химические свойства гомогенных препаратов рестриктаз.

Как видно из таблицы 19, большинство эндонуклеаз рестрикции П-го типа представляют собой белки, построенные из одной или нескольких идентичных полипептидных цепей, с относительно небольшой молекулярной массой, что, конечно, является определенным достоинством при структурных исследованиях. Отдельного рассмотрения заслуживает вопрос о четвертичной структуре эндонуклеаз рестрикции.

страница 21
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.08.2019)