|
|
Ферменты рестрикции и их применение, метилирование которых препятствует действию данной рестриктазы, выделены полужирным шрифтом. В настоящее время для ряда рестриктаз, участки узнавания которых полностью или частично перекрываются с dcm и dam сайтами, определено влияние обсуждаемого метилирования на их способность расщеплять субстрат. Эти данные представлены в. табл. 16 и 17. 60 Таблица 16 Чувствительность рестриктаз к dcm метилированию Рестриктазы, чувствительные к Рестриктазы, не чувствительные dcm метилированию к dcm метилированию Название фермента Специфичность3 Название фермента Специфичность3 (изошизомеры)® (изошизомер ы)® Ava II (Bme216 I, GGWCC BamH I (Bst I) GGATCC Есо47 I) Afl I GGWCC Ара I GGGCCC Bgl I GCCN5GGCT Asp718 I GGTACC BstE II GGTNACC Dra II RGGNCCY BstN I (Aac I, CCWGG (ЕсоОЮЭ I) Ару I, BspN I, Eae I YGGCCR Mva I, TaqX I) EcoR II (Mph I) CCWGG CviNY I CC Sau 96 I GGNCC Fok I CATCC ScrF I (Sso II) CCNGG Hae III GGCC Stu I (Aat I) AGGCCT Kpn I GGTACC Nar I GGCGCC Sfi I GGCCN5GGCC a—см. пункт «а» примечаний к табл. 12. б — в скобках приведены названия изошнзомеров аналогично реагирующих на dcm метилирование. Таблица 17 Чувствительность рестриктаз к dam метилированию Рестриктазы, чувствительные к Рестриктазы, не чувствительные к dam метилированию к dam метилированию Название фермента (изошизомеры )® Специфичность2 Название фермента (изошизомеры)® Специфичность3 Bel I (AtuC I, TGATCA BamH I (BamF I, GGATCC BspX II, BstG I, BamK I, Bst I) Cpe I) Bgl II (Ncr I) AGATCT Cla I (Ban III, ATCGAT BspM II (Mro I) TCCGGA BspX I) Pvu I (Rsh I, CGATCG Hph 1 GGTGA Xor I) Mbo I (BstE II, GATC Sau3A I (FnuE I, GATC CviA I, Dpn II, Pfa I, Dpn I*, Cfu I*, Nan II*, Mme II, Nde II) Mbo II (Ncu I) GAAGA NmuD I*, NmuE I*) Nru I (Ama I) TCGCGA Spo I TCGCGA Taq I (Tfl I, TCGA Xho I (BstYI) RGATCY TthHB I) Xba I TCTAGA Acc III TCCGGA Bin I (Alw I) GGATC Bsph I TCATGA Mfl I RGATCY a — см. пункт «а» примечаний к табл. 12. б — в скобках приведены названия нзошизомеров, аналогично реагирующих на dam метилирование. * — расщепляет только при наличии ш6 в обеих цепях узнаваемой последовательности. 61 4.4.7. Чувствительность метилаз к модификациям субстрата Чувствительностью к сайт-специфическому метилированию отличаются не только рестриктазы, но и другие белки, взаимодействующие с ДНК [357, 387]. Метилазы не являются в этом отношении исключением. Сайт-специфические модификации типа т5С, т6А, т4С и hm5C (5-гидроксиметилцитозин) в неканонических положениях иногда ингибирует действие некоторых метилаз. Сводные данные представлены в табл. 18. Таблица 18 Чувствительность метилаз к модификациям субстрата Метилаза (специфичность)3 He блокируется предвари- Блокируется предвари- тельной модификацией тельной модификацией MAlu I (AGm5CT) AGm4CT MBamH I (GGATm4CC) GGm6ATCC GGATCm5C MBst I (GGATmCC) GGm6ATCC MCfr6 I (CAGm4CTG) CAGm5CTG MCla I (ATCGm6AT) m6ATCGAT ATm5CGAT MCviB III (TCGm6A) Tm5CGA MEcoR I (GAm6ATTC) GAATTm5C Gm6AATTC MEcoR II (Cm5CWGG) Cm4CWGG MEco dam (Gm6ATC) GATm5C GAThm5C GATm4C MFok IA (GGm6ATG) CATCm5C CATm5CC MHha I (Gm5CGC) GCG^C MHha II (Gm6ANTC) GANTm5C МНра II (C^CGC) m5CCGG MHph I (Tm5CACC) GGTGm6A MMbo I (Gm6ATC) GATm5C MMbo II (GAAGm6A) Tm5CTTm5C MMsp I (m5CCGG) Cm5CGG MMva I (Cm4CWGG) Cm5CWGG MPvu II (CAGm4CTG) CAGm5CTG MEcoT2 dam (Gm6ATY) GAThm5C MEcoT4 dam (Gm6ATC) GAThm5C MTaq I (TCGm6A) Tm5CGA a — см пункт «а» примечаний к табл. 12., б — см. пункт «б» примечаний к табл. 13. Интересно отметить, что имеется пример отсутствия ингиби-ции реакции метилирования даже в случае действия на субстрат метилаз, узнающих одинаковые последовательности нуклеотидов, и модифицирующих одно и то же основание в разных метах. Речь идет о MEcoR II и MMva I, которые узнают последовательность 5'CC(A/T)GG и модифицируют цитозин, расположенный рядом с осью симметрии, образуя ш5С и ш4С соответ- 62 ственно. Последовательная обработка in vitro субстрата MEcoR II и MMva I приводит к образованию №,5-диметилци-тозина [103]. Таким образом MMva I оказалась нечувствительной к метилированию цитозинового остатка по 5-тому положению. Модификация по ^-положению, наоборот ингибирует MEcoR II. В другом аналогичном исследованном случае, касающемся ферментов MAlu I, MPvu II (и ее изаметимера MCfr6 I), узнающих соответственно 5'AGCT (образуется т5С) и 5'CAGCTG (образуется ш4С) имела место ингибиция последующего альтернативного метилирования по этому же цитозиново-му остатку [102]. Как следует из данных представленных в табл 18, аналогично реагирует на модификацию субстрата MBamH I. 4.5. Практическое применение сведений о различных проявлениях субстратной специфичности рестриктаз Сведения о различных проявлениях субстратной специфичности рестриктаз, наряду с их теоретической значимостью, имеют большое практическое значение — являются предпосылкой для целенаправленного использования этих ферментов в различных отраслях их применения в качестве аналитических реагентов. В первую очередь это замечание относится к изучению специфики метилирования эукариотической ДНК- В этой ДНК в качестве минорного основания присутствует 5-метилцитозин [46, 129]. Подавляющее его большинство содержится в составе CG-динуклеотида [46, 129]. Именно использование рестриктаз, чувствительных к метилированию цитозина, впервые открыло возможность изучать вышеуказанный вопрос [124, 129, 379, 416]. Интересным практическим приложением чувствительности рестриктаз к метилированию является создание при его помощи новых вариантов фрагментирования субстрата [274]. Этот метод заключается в модификации ДНК сайт-специфической метилазой, узнаваемый участок которой частично перекрывается с таковым рестриктазы, при помощи которой предполагается расщеплять субстрат. Таким приемом можно изменить частоту расщепления субстратной ДНК- Например, рестриктаза Nhe I способна расщеплять ДНК аденовируса-2 в четырех местах, содержащих последовательность 5'GCTAGC. Метилирование этой ДНК при помощи метилазы Alu I, модифицирующей цитозино-вый остаток в последовательности 5'AGmCT [25], в перекрывающихся участках (5'AGmCTAGC) делает устойчивой к действию Nhe I последовательность 5'GCTAGC [274]. Вследствие этого Nhe I расщепляет ДНК аденовируса-2 только в одном участке [274]. Таким образом in vitro можно достичь совершенно нового варианта фрагментирования ДНК, неосуществимого ни одной известной рестриктазой. Набор имеющихся рестриктаз и метилаз в настоящее время позволяет получать десятки вариантов фрагментации ДНК [22, 274]. Особенно следует выделить работы, направленные |
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 |
Скачать книгу "Ферменты рестрикции и их применение" (1.59Mb) |
[каталог] [статьи] [доска объявлений] [обратная связь] |